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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 双酶切总是弥散，求助
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maoxixi

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切总是弥散，求助 已有2人参与

用NdeI和NotI双酶切连接上目的片段的pmd-18t，载体已测序，有酶切位点，切了两次，一次3个小时，一次过夜酶切，效果都差不多，没有明显条带，弥散一片。求指教，拜托了！！！

双酶切总是弥散，求助
Administrator 2011-09-23 20hr 27min.jpg
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1楼 2014-09-24 13:33:16
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-24 16:18:26
maoxixi: 金币+5, ★有帮助 2014-10-01 15:21:41
会不会是酶时间久了不好用，酶切时间过长也容易弥散
要不然就是这个载体降解了，都有可能
你把原始载体点胶看看
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
2楼2014-09-24 13:36:50
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ccandcc

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-09-24 16:18:37
其实楼上说的很好！
我觉得你的载体被细菌降解了。
验证这个很简单，你跑胶的时候放没有加酶切，没被任何处理的载体了吗？
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3楼2014-09-24 13:43:30
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maoxixi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 可帅儿 at 2014-09-24 13:36:50
会不会是酶时间久了不好用，酶切时间过长也容易弥散
要不然就是这个载体降解了，都有可能
你把原始载体点胶看看

原始载体也点在旁边了，是右边的那条带，点了2.5微升，有条带。载体浓度也测了，70ng/μl
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4楼2014-09-24 14:08:47
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by maoxixi at 2014-09-24 14:08:47
原始载体也点在旁边了，是右边的那条带，点了2.5微升，有条带。载体浓度也测了，70ng/μl...

好弱呀~量太少了，酶切载体要量足才行。
另外确保没质量没问题吧！
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追随自己的心！不要做让自己后悔的事！
5楼2014-09-24 16:36:29
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永远一片天

新虫 (正式写手)
酶切后建议点个小孔的样做个对照看一下，三个泳道即酶切后质粒，酶切前质粒，marker。这样可以确认一下是否是酶切之前的质粒有问题。。
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6楼2014-10-19 10:20:35
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