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maoxixi

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切总是弥散,求助 已有2人参与

用NdeI和NotI双酶切连接上目的片段的pmd-18t,载体已测序,有酶切位点,切了两次,一次3个小时,一次过夜酶切,效果都差不多,没有明显条带,弥散一片。求指教,拜托了!!!

双酶切总是弥散,求助
Administrator 2011-09-23 20hr 27min.jpg
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-09-24 16:18:26
maoxixi: 金币+5, 有帮助 2014-10-01 15:21:41
会不会是酶时间久了不好用,酶切时间过长也容易弥散
要不然就是这个载体降解了,都有可能
你把原始载体点胶看看
追随自己的心!不要做让自己后悔的事!
2楼2014-09-24 13:36:50
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ccandcc

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-09-24 16:18:37
其实楼上说的很好!
我觉得你的载体被细菌降解了。
验证这个很简单,你跑胶的时候放没有加酶切,没被任何处理的载体了吗?
3楼2014-09-24 13:43:30
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maoxixi

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 可帅儿 at 2014-09-24 13:36:50
会不会是酶时间久了不好用,酶切时间过长也容易弥散
要不然就是这个载体降解了,都有可能
你把原始载体点胶看看

原始载体也点在旁边了,是右边的那条带,点了2.5微升,有条带。载体浓度也测了,70ng/μl
4楼2014-09-24 14:08:47
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可帅儿

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by maoxixi at 2014-09-24 14:08:47
原始载体也点在旁边了,是右边的那条带,点了2.5微升,有条带。载体浓度也测了,70ng/μl...

好弱呀~量太少了,酶切载体要量足才行。
另外确保没质量没问题吧!
追随自己的心!不要做让自己后悔的事!
5楼2014-09-24 16:36:29
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永远一片天

新虫 (正式写手)

酶切后建议点个小孔的样做个对照看一下,三个泳道即酶切后质粒,酶切前质粒,marker。这样可以确认一下是否是酶切之前的质粒有问题。。
6楼2014-10-19 10:20:35
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