应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助！！！双酶切连接不上这是为什么
283/3返回列表上一页123
查看: 2201  |  回复: 27
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jianguochen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:02:55
质粒测过序，是没有问题的，这样还需要进行纯质粒的转化吗...

我是这么认为的，从电泳来看，你并没有酶切成功，但是在没有酶切开来的情况下，你用这个产物进行连接转化，就算没有连接成功，那其中也还有环状质粒，这种情况下也没有长菌斑的话，那转化本身效率就有问题，所以做纯质粒转化只是一个排查问题的过程。当然，你最重要的还是要先将质粒切开。我也没有试过两种酶依次做的双酶切，所以对你这种方法不太了解，是否会有酶切开来的粘性末端自连的情况。可以尝试下双酶切体系嘛。
赞一下 回复此楼
21楼2015-10-15 18:28:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool
引用回帖:
11楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:01:32
我分别做了Kpn1和Not1的单酶切，跑胶可以看出来是切成功的，但是一做双酶切就失败...

这说明你可能根本就没有链接上目的片段，你双酶切的可能是空载或链接有杂基因～只是猜想。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
22楼2015-10-15 18:39:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

15853830932

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 13:59:06
做了转化也没有成功，长的都是background,不是我构建的质粒...

是做infusion后转的吗？你做个酶切完的直接化转，看看长不长啊。如果张很多，那就是没切开。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
If you shed tear when you miss the sun, you also miss the stars.
23楼2015-10-16 08:32:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

薇筱123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-10-16 08:32:05
是做infusion后转的吗？你做个酶切完的直接化转，看看长不长啊。如果张很多，那就是没切开。
...

今天去试一下
回复此楼
24楼2015-10-16 09:00:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

湘西小伙儿

金虫 (正式写手)
你前面的双酶切都没看见两条带怎么保证后面的转化

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
25楼2015-10-16 09:06:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

牛红

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先要确定的是切400bp片段是否成功，看不到短片段的原因有可能酶切体系不对造成失败，也可能电泳时间太长导致小片段弥散因此看不到条带。
其次，6600bp连接20bp你算一下连接体系的长短片段mol比，大片段尽量少加，因为含粘性末端的dna连接本来就是一个概率事件，并不是量越多越容易连接成功。
在外包公司帮客户做过两年定制服务，很理解你的痛苦，按以上两点你先试一下

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
赢得不够是因为心智还不够高远
26楼2015-10-16 09:23:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

博友航生物

捐助贵宾 (初入文坛)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
求关注，希望能帮到您
赞一下 回复此楼
27楼2015-10-16 11:01:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hugeneuron

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
双酶切不成功就做两个单酶切看看是哪个酶切没成功。

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
28楼2015-10-16 11:13:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 薇筱123 的主题更新
283/3返回列表上一页123
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 4/200 2026-08-04 04:54 by k7OM8YghWbkC
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 7/350 2026-08-04 04:50 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 6/300 2026-08-04 04:47 by k7OM8YghWbkC
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 04:47 by k7OM8YghWbkC
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 7/350 2026-08-04 04:46 by k7OM8YghWbkC
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 04:46 by k7OM8YghWbkC
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 5/250 2026-08-04 04:44 by k7OM8YghWbkC
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 04:41 by k7OM8YghWbkC
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 9/450 2026-08-04 03:56 by kf2781974
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 jRl3mE6ddZGq 2026-08-03 7/350 2026-08-04 03:35 by k7OM8YghWbkC
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 8/400 2026-08-04 03:21 by k7OM8YghWbkC
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 cu9Nq1xK233Z 2026-08-03 12/600 2026-08-04 03:17 by k7OM8YghWbkC
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
[高分子] UV压敏胶开发 +3 ichall 2026-07-30 5/250 2026-08-03 14:40 by Sunrisepay
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 16/800 2026-08-03 12:23 by fuweiguochen
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +19 低垂的野花 2026-07-31 25/1250 2026-08-03 09:25 by gy116024
[基金申请] 2026年国自然面上资助率 +16 布布和一二 2026-07-30 22/1100 2026-08-03 09:20 by gy116024
[教师之家] 基础研究怎么拉横向，学校到款任务越来越多，难以完成 拉横向，都有哪些途径啊 +8 锦衣卫寒战 2026-07-28 12/600 2026-08-03 08:22 by syl200707
[考博] 2027年申博 50+3 射雕英雄胜 2026-07-30 3/150 2026-08-02 09:36 by lfy8008
[基金申请] 你们的时间戳变了吗 +3 archvillain 2026-07-30 4/200 2026-07-30 18:53 by levinzhwen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭