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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助！！！双酶切连接不上这是为什么
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jianguochen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:02:55
质粒测过序，是没有问题的，这样还需要进行纯质粒的转化吗...

我是这么认为的，从电泳来看，你并没有酶切成功，但是在没有酶切开来的情况下，你用这个产物进行连接转化，就算没有连接成功，那其中也还有环状质粒，这种情况下也没有长菌斑的话，那转化本身效率就有问题，所以做纯质粒转化只是一个排查问题的过程。当然，你最重要的还是要先将质粒切开。我也没有试过两种酶依次做的双酶切，所以对你这种方法不太了解，是否会有酶切开来的粘性末端自连的情况。可以尝试下双酶切体系嘛。
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21楼2015-10-15 18:28:04
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ocean_of_yu

木虫 (正式写手)

Cool
引用回帖:
11楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:01:32
我分别做了Kpn1和Not1的单酶切，跑胶可以看出来是切成功的，但是一做双酶切就失败...

这说明你可能根本就没有链接上目的片段，你双酶切的可能是空载或链接有杂基因～只是猜想。

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22楼2015-10-15 18:39:56
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15853830932

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 13:59:06
做了转化也没有成功，长的都是background,不是我构建的质粒...

是做infusion后转的吗？你做个酶切完的直接化转，看看长不长啊。如果张很多，那就是没切开。

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If you shed tear when you miss the sun, you also miss the stars.
23楼2015-10-16 08:32:05
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 15853830932 at 2015-10-16 08:32:05
是做infusion后转的吗？你做个酶切完的直接化转，看看长不长啊。如果张很多，那就是没切开。
...

今天去试一下
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24楼2015-10-16 09:00:37
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湘西小伙儿

金虫 (正式写手)
你前面的双酶切都没看见两条带怎么保证后面的转化

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25楼2015-10-16 09:06:49
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牛红

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先要确定的是切400bp片段是否成功，看不到短片段的原因有可能酶切体系不对造成失败，也可能电泳时间太长导致小片段弥散因此看不到条带。
其次，6600bp连接20bp你算一下连接体系的长短片段mol比，大片段尽量少加，因为含粘性末端的dna连接本来就是一个概率事件，并不是量越多越容易连接成功。
在外包公司帮客户做过两年定制服务，很理解你的痛苦，按以上两点你先试一下

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赢得不够是因为心智还不够高远
26楼2015-10-16 09:23:40
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博友航生物

捐助贵宾 (初入文坛)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
求关注，希望能帮到您
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27楼2015-10-16 11:01:25
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hugeneuron

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
双酶切不成功就做两个单酶切看看是哪个酶切没成功。

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28楼2015-10-16 11:13:29
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