5楼: Originally posted by ocean_of_yu at 2015-10-15 07:53:41
感觉你的酶切就有问题，优化酶切体系和条件，确认一下是不是质粒和目的基因上都有相同的酶切位点～

6楼: Originally posted by jianguochen at 2015-10-15 09:16:43
感觉比较奇怪.如果双酶切下400bp的条带的话，那么电泳上不应该看不出来。如果没有酶切成功，用的质粒去做连接转化，那质粒的转化效率应该是比较高的。可以用纯质粒做一次转化，看看能不能转化成功。

2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-15 01:31:57
你这描述的就是不想让别人能帮得上忙的样子。。。。

7楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-15 09:43:56
首先，你双酶切跑电泳没有400bp条带，基本是证明你酶切不成功，就更不要提后面的连接了，你把你的酶切条件展示出来给大伙看看，让大家给你分析分析，利于你一步一步把问题解决了。
再者，你的目的片段只有20bp，片 ...

14楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:09:04
酶切体系 载体 6ul
             Not1 1ul
             buffer 5ul
             水   38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切


目的片段通过退火得到的，有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做 ...

14楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:09:04
酶切体系 载体 6ul
             Not1 1ul
             buffer 5ul
             水   38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切


目的片段通过退火得到的，有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做 ...

15楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-15 14:27:04
双酶切应该是都加在一个体系的吧，我们之前做的都是把两种酶加在一个体系中，各加1uL，酶切完直接跑电泳看看，切出条带了的就做纯化。我不知道你这样一个一个切会不会有影响...

16楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-15 14:37:59
我之前做单酶切也比较多，单酶切后如果不做去磷酸化处理，很可能会出现自连或者跟其他片段互相连接的情况，你先用not1切，相当于一个单酶切，容易出现各种问题，我建议还是两个酶加在一起，做一个双酶切体系试试...

18楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 15:57:08
就是因为没有同时适用于这两个酶的Buffer才做的两次单酶切...

18楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 15:57:08
就是因为没有同时适用于这两个酶的Buffer才做的两次单酶切...