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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 求助！！！双酶切连接不上这是为什么
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by ocean_of_yu at 2015-10-15 07:53:41
感觉你的酶切就有问题，优化酶切体系和条件，确认一下是不是质粒和目的基因上都有相同的酶切位点～

我分别做了Kpn1和Not1的单酶切，跑胶可以看出来是切成功的，但是一做双酶切就失败
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11楼2015-10-15 14:01:32
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by jianguochen at 2015-10-15 09:16:43
感觉比较奇怪.如果双酶切下400bp的条带的话，那么电泳上不应该看不出来。如果没有酶切成功，用的质粒去做连接转化，那质粒的转化效率应该是比较高的。可以用纯质粒做一次转化，看看能不能转化成功。

质粒测过序，是没有问题的，这样还需要进行纯质粒的转化吗
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12楼2015-10-15 14:02:55
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-15 01:31:57
你这描述的就是不想让别人能帮得上忙的样子。。。。

刚接触这方面啊，不专业，那我应该怎样描述
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13楼2015-10-15 14:04:19
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-15 09:43:56
首先，你双酶切跑电泳没有400bp条带，基本是证明你酶切不成功，就更不要提后面的连接了，你把你的酶切条件展示出来给大伙看看，让大家给你分析分析，利于你一步一步把问题解决了。
再者，你的目的片段只有20bp，片 ...

酶切体系 载体 6ul
             Not1 1ul
             buffer 5ul
             水   38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切


目的片段通过退火得到的，有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做过转化
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14楼2015-10-15 14:09:04
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liping121200

铜虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:09:04
酶切体系 载体 6ul
             Not1 1ul
             buffer 5ul
             水   38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切


目的片段通过退火得到的，有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做 ...

双酶切应该是都加在一个体系的吧，我们之前做的都是把两种酶加在一个体系中，各加1uL，酶切完直接跑电泳看看，切出条带了的就做纯化。我不知道你这样一个一个切会不会有影响
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好好学习，天天向上
15楼2015-10-15 14:27:04
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liping121200

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
薇筱123: 金币+1 2015-12-28 11:33:20
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14楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:09:04
酶切体系 载体 6ul
             Not1 1ul
             buffer 5ul
             水   38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切


目的片段通过退火得到的，有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做 ...

我之前做单酶切也比较多，单酶切后如果不做去磷酸化处理，很可能会出现自连或者跟其他片段互相连接的情况，你先用not1切，相当于一个单酶切，容易出现各种问题，我建议还是两个酶加在一起，做一个双酶切体系试试
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16楼2015-10-15 14:37:59
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
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15楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-15 14:27:04
双酶切应该是都加在一个体系的吧，我们之前做的都是把两种酶加在一个体系中，各加1uL，酶切完直接跑电泳看看，切出条带了的就做纯化。我不知道你这样一个一个切会不会有影响...

两个酶的Buffer不一样，所以没法一次双酶切
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17楼2015-10-15 15:54:13
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薇筱123

新虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by liping121200 at 2015-10-15 14:37:59
我之前做单酶切也比较多，单酶切后如果不做去磷酸化处理，很可能会出现自连或者跟其他片段互相连接的情况，你先用not1切，相当于一个单酶切，容易出现各种问题，我建议还是两个酶加在一起，做一个双酶切体系试试...

就是因为没有同时适用于这两个酶的Buffer才做的两次单酶切
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18楼2015-10-15 15:57:08
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liping121200

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18楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 15:57:08
就是因为没有同时适用于这两个酶的Buffer才做的两次单酶切...

一般来说，两种酶能找到通用缓冲液，takara的公司目录上就有双酶切反应的通用缓冲液的使用表。你看能不能找到
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19楼2015-10-15 16:52:24
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liping121200

铜虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 15:57:08
就是因为没有同时适用于这两个酶的Buffer才做的两次单酶切...

双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer；如果两种酶厂家不同无法查时可比较其 buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和；任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积，而且最大反应体系最好不要小于20 ul。如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳后胶回收或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，如CIAP；有的则不行。
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20楼2015-10-15 16:55:15
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