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薇筱123

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!!!双酶切连接不上这是为什么 已有7人参与

实验想要让一个7000左右bp的质粒载体变小一点,所以用Kpn1和Not1双酶切,切下一个400bp左右的片段,跑胶,但是看不到400bp的条带,然后In-fusion连上一个20bp左右的片段,然后转化,涂板子,都不长菌,这是说明我的双酶切没成功还是没有连上那个20bp的片段,我要怎样改进实验呢?求指导!都重复实验好几次了,都成功不了啊!
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liping121200

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


薇筱123: 金币+1 2015-12-28 11:33:20
引用回帖:
14楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:09:04
酶切体系 载体 6ul
             Not1 1ul
             buffer 5ul
             水   38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切


目的片段通过退火得到的,有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题,其他人也用它做 ...

我之前做单酶切也比较多,单酶切后如果不做去磷酸化处理,很可能会出现自连或者跟其他片段互相连接的情况,你先用not1切,相当于一个单酶切,容易出现各种问题,我建议还是两个酶加在一起,做一个双酶切体系试试
好好学习,天天向上
16楼2015-10-15 14:37:59
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查看全部 28 个回答

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:11:32
你这描述的就是不想让别人能帮得上忙的样子。。。。
2楼2015-10-15 01:31:57
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thetc

木虫 (小有名气)


myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2015-10-15 18:11:39
查一下你那2个酶的最适条件,把你实验的条件调整调整把。

发自小木虫IOS客户端
加入,希望能学习多一点
3楼2015-10-15 07:35:22
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厚德求是

金虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:11:54
转化不成功的原因可能有非常多,连接酶的效率,反应的条件,感受态的效率,抗性的选择。建议设立对照组,逐一排查上述问题。

发自小木虫IOS客户端
4楼2015-10-15 07:42:19
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