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薇筱123

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 4081526
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专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 求助！！！双酶切连接不上这是为什么已有7人参与

实验想要让一个7000左右bp的质粒载体变小一点，所以用Kpn1和Not1双酶切，切下一个400bp左右的片段，跑胶，但是看不到400bp的条带，然后In-fusion连上一个20bp左右的片段，然后转化，涂板子，都不长菌，这是说明我的双酶切没成功还是没有连上那个20bp的片段，我要怎样改进实验呢？求指导！都重复实验好几次了，都成功不了啊！

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1楼 2015-10-14 10:12:18

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liping121200

铜虫 (小有名气)

应助: 30 (小学生)
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虫号: 4060168
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专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★
薇筱123: 金币+1 2015-12-28 11:33:20

引用回帖:

14楼: Originally posted by 薇筱123 at 2015-10-15 14:09:04
酶切体系载体 6ul
         Not1 1ul
         buffer 5ul
         水 38ul
然后纯化再进行Kpn1酶切

目的片段通过退火得到的，有酶切位点

感受态细胞应该没什么问题，其他人也用它做 ...

我之前做单酶切也比较多，单酶切后如果不做去磷酸化处理，很可能会出现自连或者跟其他片段互相连接的情况，你先用not1切，相当于一个单酶切，容易出现各种问题，我建议还是两个酶加在一起，做一个双酶切体系试试