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求助！！！双酶切连接不上这是为什么 已有7人参与
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| 实验想要让一个7000左右bp的质粒载体变小一点，所以用Kpn1和Not1双酶切，切下一个400bp左右的片段，跑胶，但是看不到400bp的条带，然后In-fusion连上一个20bp左右的片段，然后转化，涂板子，都不长菌，这是说明我的双酶切没成功还是没有连上那个20bp的片段，我要怎样改进实验呢？求指导！都重复实验好几次了，都成功不了啊！ |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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首先要确定的是切400bp片段是否成功，看不到短片段的原因有可能酶切体系不对造成失败，也可能电泳时间太长导致小片段弥散因此看不到条带。 其次，6600bp连接20bp你算一下连接体系的长短片段mol比，大片段尽量少加，因为含粘性末端的dna连接本来就是一个概率事件，并不是量越多越容易连接成功。 在外包公司帮客户做过两年定制服务，很理解你的痛苦，按以上两点你先试一下 发自小木虫Android客户端 |
26楼2015-10-16 09:23:40
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
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2楼2015-10-15 01:31:57
thetc
木虫 (小有名气)
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3楼2015-10-15 07:35:22
厚德求是
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:11:54
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-15 18:11:54
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转化不成功的原因可能有非常多，连接酶的效率，反应的条件，感受态的效率，抗性的选择。建议设立对照组，逐一排查上述问题。 发自小木虫IOS客户端 |
4楼2015-10-15 07:42:19