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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切回收柱未晾干，对连接影响大么
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hflf

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切回收柱未晾干，对连接影响大么 已有12人参与

双酶切胶回收最后一步，加TE溶解前没有把柱子晾干，可能柱中还有washing buffer，是不是对下一步的连接反应影响很大？我转化涂平板之后发现没有连接成功，其他步骤都没有问题，不知道是不是就是这一步出问题了，有哪位虫友遇到过相似的情况，交流一下啊，谢谢！
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行到水穷处，坐看云起时！
1楼 2010-05-13 09:30:24
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
hflf(金币+1):是有问题，但是感觉应该不会影响这么大吧，一个克隆都没长。 2010-05-13 09:34:33
有问题的，乙醇会影响连接的
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2楼2010-05-13 09:31:19
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liyong1981

金虫 (正式写手)
我回帖，楼主给我金币吧
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3楼2010-05-13 09:37:43
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liyong1981

金虫 (正式写手)
大家讨论下啊，这连接有时候连不上，怎么回事呢，我们都是目测浓度，没有测DNA的仪器～
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4楼2010-05-13 09:43:33
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liyong1981

金虫 (正式写手)
我友情的帮你顶下～
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5楼2010-05-13 09:55:53
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
hflf(金币+1):晾的特别干是个什么概念，在常温晾多久？还是其他方法？ 2010-05-13 10:54:14
肯定会影响，多大就不知道了。我一般晾的特别干。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-05-13 10:01:34
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)
乙醇是挺容易挥发的，可以试试用浓缩仪把样品浓缩一下下，从而把酒精挥发掉
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7楼2010-05-13 10:51:45
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liyong1981

金虫 (正式写手)
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8楼2010-05-13 10:55:25
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cqyniu

金虫 (小有名气)
hflf(金币+1):空离了，但是没有晾干，直接加了TE，结果就是出不来啊， 2010-05-13 11:22:28
有影响的，还有乙醇会影响连接酶的活性的，你回收最后一步没有空离吗？
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9楼2010-05-13 11:01:05
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随风而逝

金虫 (小有名气)
★
hflf(金币+1):看来只能重做了， 2010-05-13 11:21:36
lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-05-13 21:46:20
连接酶是分子克隆里面差不多最弱的酶了，washing buffer 没有洗干净，乙醇会使酶失活，连不上的。
碰到这种情况，你只能重新做了，以前的DNA片段再回收产率太低，虽说连接酶效率高，但一般量少于0.1微克你是连不上的。
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10楼2010-05-13 11:17:51
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