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hflf

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切回收柱未晾干,对连接影响大么已有12人参与

双酶切胶回收最后一步,加TE溶解前没有把柱子晾干,可能柱中还有washing buffer,是不是对下一步的连接反应影响很大?我转化涂平板之后发现没有连接成功,其他步骤都没有问题,不知道是不是就是这一步出问题了,有哪位虫友遇到过相似的情况,交流一下啊,谢谢!
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行到水穷处,坐看云起时!
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)

hflf(金币+1):是有问题,但是感觉应该不会影响这么大吧,一个克隆都没长。 2010-05-13 09:34:33
有问题的,乙醇会影响连接的
2楼2010-05-13 09:31:19
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liyong1981

金虫 (正式写手)


我回帖,楼主给我金币吧
3楼2010-05-13 09:37:43
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liyong1981

金虫 (正式写手)


大家讨论下啊,这连接有时候连不上,怎么回事呢,我们都是目测浓度,没有测DNA的仪器~
4楼2010-05-13 09:43:33
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liyong1981

金虫 (正式写手)


我友情的帮你顶下~
5楼2010-05-13 09:55:53
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

hflf(金币+1):晾的特别干是个什么概念,在常温晾多久?还是其他方法? 2010-05-13 10:54:14
肯定会影响,多大就不知道了。我一般晾的特别干。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-05-13 10:01:34
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)

乙醇是挺容易挥发的,可以试试用浓缩仪把样品浓缩一下下,从而把酒精挥发掉
7楼2010-05-13 10:51:45
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liyong1981

金虫 (正式写手)

顶一下
8楼2010-05-13 10:55:25
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cqyniu

金虫 (小有名气)

hflf(金币+1):空离了,但是没有晾干,直接加了TE,结果就是出不来啊, 2010-05-13 11:22:28
有影响的,还有乙醇会影响连接酶的活性的,你回收最后一步没有空离吗?
9楼2010-05-13 11:01:05
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随风而逝

金虫 (小有名气)


hflf(金币+1):看来只能重做了, 2010-05-13 11:21:36
lstt09nk(金币+1):感谢交流~~ 2010-05-13 21:46:20
连接酶是分子克隆里面差不多最弱的酶了,washing buffer 没有洗干净,乙醇会使酶失活,连不上的。
碰到这种情况,你只能重新做了,以前的DNA片段再回收产率太低,虽说连接酶效率高,但一般量少于0.1微克你是连不上的。
10楼2010-05-13 11:17:51
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