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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PGEX为何胶回收时只做双酶切？
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雨林碟影

铜虫 (初入文坛)

[交流] PGEX为何胶回收时只做双酶切？ 已有5人参与

转了几次都不长
  怀疑载体出了问题
  今早又重新提质粒PGEX
  PGEX为何只做双酶切？而不做单酶切


都做到最后一步转菌了
但不长

[ Last edited by 1949stone on 2011-6-1 at 11:38 ]
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1楼 2011-06-01 10:59:59
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雨林碟影

铜虫 (初入文坛)
都做到最后一步转菌了
但不长
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2楼2011-06-01 11:00:48
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chiangscn

银虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-06-02 09:06:55
很可能是你的感受态细胞失效了，用pUC等测试过吗?
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wholaughslastlaughsbest
3楼2011-06-01 20:29:00
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d1emon

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:07:09
1、单酶切也可以，只是连接的目的片段有方向问题，转化成功后需要进一步筛选，所以大都采用双酶切。
2、转化不成功大都是连接体系的问题，看看你的酶切产物的浓度是否合适，还有就是换个新制备的感受态细胞试试。
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4楼2011-06-02 06:19:08
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 18:49:21
载体一般不会有问题的，连接酶没有失活吧，转化做阳性对照了吗？感受态细胞有没有做过测试，效率如何。连接温度是否合适，时间是否足够。
这些问题都回答了，你就做出来了
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5楼2011-06-02 09:48:19
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雨林碟影

铜虫 (初入文坛)
转了三次了，都是不长
连接体系是10ul，一个小时，T4连接酶0.2ul,感受态换过了
都做到了最后一步还是这个样子
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6楼2011-06-02 14:54:40
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ET生物人

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 欢迎交流 2011-06-03 11:01:05
引用回帖:
Originally posted by 雨林碟影 at 2011-06-02 14:54:40:
转了三次了，都是不长
连接体系是10ul，一个小时，T4连接酶0.2ul,感受态换过了
都做到了最后一步还是这个样子

确定你的载体是正确的？？pGEX载体上的抗性基因与你用的平板的抗性基因一致？尝试一下换另一个载体来做！！
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7楼2011-06-03 09:59:36
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sci1234

金虫 (小有名气)

路人甲
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是转了三次都不长，我的是转了两次都只把空载体转进去了，没有连上目的基因，载体也不自连。不过你的情况我在做其他载体时遇到过，当时我做不出来的原因可能是没有酶切好，并且你酶切回收时要把琼脂去干净，否则会影响连接和转化。
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sci1234
8楼2012-12-12 21:23:02
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