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用Hoechst33342/PI 双染做流式，居然只检测到坏死细胞，这是个什么状况
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今天做了流式，是用凯基的Hoechst33342/PI 双染试剂盒来检测细胞凋亡，但是结果出来之后发现，坏死细胞特别多，凋亡的细胞就没几颗，而且散点图显示，细胞特别分散，我不知道这是个什么原因？ 我的是贴壁细胞，我是在染完之后才消化的，然后直接用培养基终止消化，吹打成单个细胞，然后去检测;在染色之前我用多聚甲醛对细胞进行了固定？那这个固定队细胞坏死有没有很大影响呢？ Hoechst33342 它可以穿过活细胞的膜，区分凋亡和正常细胞，但在我做的流式结果里，怎么没有差别呢？求指点。谢谢啊 |
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-06-15 13:50:16
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我发现一个问题，楼主的细胞是先加染料，再消化。这顺序应该是相反了啊。一般都是先消化，再加染料。我查证了一下该产品说明书，确实如此。http://www.keygentec.com.cn/productdetails/168.html 希望该信息对你有帮助呀。 另外，做细胞凋亡实验，选用Annexin V-FITC/PI双染检测，更常见一些。这种试剂盒，能检测到正常细胞、早晚期凋亡细胞、坏死细胞以外，还可以反应机械性损伤的细胞，共分为为四个部分。而你所采用的试剂盒，反映出来的只有前三部分。 好了，祝你下回实验成功！ |
2楼2012-06-14 22:17:31
tonyprague1967
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3楼2012-06-14 23:18:47
tonyprague1967
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4楼2012-06-14 23:20:16
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真的很感谢你。 其实到底是先加染料还是先消化的问题，我也查了很多，基本上都是先消化后染色，但是我认为如果先消化的话，终止消化后得离心，用PBS洗也得离心，每次染完清洗都得离心，这样对细胞的损伤太大，也会造成细胞的大量流失，我那个是贴壁细胞，我如果先染色在消化，我就基本不会去离心，那样对细胞造成的损伤比较小，当然我一直没有想出这样做的缺点在哪里，呵呵所以就这样做了。 你传的说明书我看过了，呵呵，谢谢你，这个我也是研究了好久，但是确实没找到到底一定是要先消化吗？呵呵 PI对细胞的毒性比较大，我只在常温下避光孵育10分钟，我不知道这个时间是否合适？ Hoechst 相对于PI 来说，对于膜是有很强的通透性，但是就是因为只有当膜不完整时，PI 才能进入嵌入到DNA中，使坏死细胞着色，那我这个坏死的也太多了。 至于用不用多聚甲醛固定，我今天重新做了一次，没固定，但是结果和昨天做的还是一样的，所以我觉得重点不在多聚甲醛上。 阴性对照是完全都不染，里面的坏死细胞也挺多的，但是我不明白怎么是PI 的问题呢？嘿嘿 谢谢你啊 |
5楼2012-06-15 11:22:07
【答案】应助回帖
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首先，你决定选用该试剂盒，就应该严格按照说明书的操作进行，不用怕麻烦，不然，实验中出现问题时，容易耽误时间和浪费材料。这份说明，说到的操作蛮详细的，应该有小小的指导作用，呵呵。 另外，出现坏死细胞较多，可能的原因，我暂且肯定不了。我顺便查找了这种试剂盒是否有注意事项，找到丁香园的一个帖子：http://www.biomart.cn/infosupply/6530705.htm，它在这里面提到，消化细胞时注意（贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性。），一般不含EDTA的胰酶，可以自己配制或购买现成的。胰酶是否需要加EDTA要看具体做什么实验，所以你也可以再找找相关的帖子，多了解一下。 成功的实验，需要好的准备，所以多花点时间，先了解实验的方法原理，注意事项，再度出发，呵呵。 |
6楼2012-06-15 17:46:21
l_h_10
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【答案】应助回帖
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你的最关键的问题是 用多聚甲醛固定了，固定之后，活细胞都变成了死细胞了。我觉得Hoechst33342/PI 双染这个试剂盒更适用于染色后在荧光显微镜下观察，我用过这个方法，在显微镜下观察。并且这个方法我们习惯是，细胞先染PI，让PI进入膜有损伤的细胞，然后多聚甲醛固定，接着染hoechst 33342，让其进入所有细胞，然后放到荧光显微镜下观察。在hoechst和PI的通道上分别拍照片，然后把照片叠加。 个人认为用流式测细胞凋亡的话，还是用AV/PI的试剂盒检测，AV染早期凋亡的细胞，PI染晚期凋亡和坏死的细胞，这个试剂盒我们一直在用。 |
7楼2012-06-16 14:45:38
l_h_10
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还有个问题，就是先用胰酶消化，后染色的原因，我认为主要是染料的浓度一般都会高一些，所以染完后都会进行离心洗涤，将未与细胞结合的染料洗掉，要是不洗的话，背景值太高，导致各个组别的差异不明显。另一种染料染完后，也要洗去多余的染料的。 你讲得先染色，再消化这个方法。我没试过，但是我觉得存下面问题： 染料进入细胞后，进行消化的话，细胞在非正常状态下，可能经受不了胰酶，胰酶消化过的话，也会对细胞膜造成损伤的，你的未染组大部分是坏死细胞，可能就是因为胰酶效果过度的问题。 建议你用先消化，后染色的方法试一下。注意消化不要过度，吹打轻柔，染料的特点都在细胞膜的通透性上，一定注意不要损伤细胞膜。 |
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