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用Hoechst33342/PI 双染做流式，居然只检测到坏死细胞，这是个什么状况
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今天做了流式，是用凯基的Hoechst33342/PI 双染试剂盒来检测细胞凋亡，但是结果出来之后发现，坏死细胞特别多，凋亡的细胞就没几颗，而且散点图显示，细胞特别分散，我不知道这是个什么原因？ 我的是贴壁细胞，我是在染完之后才消化的，然后直接用培养基终止消化，吹打成单个细胞，然后去检测;在染色之前我用多聚甲醛对细胞进行了固定？那这个固定队细胞坏死有没有很大影响呢？ Hoechst33342 它可以穿过活细胞的膜，区分凋亡和正常细胞，但在我做的流式结果里，怎么没有差别呢？求指点。谢谢啊 |
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l_h_10
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【答案】应助回帖
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还有个问题，就是先用胰酶消化，后染色的原因，我认为主要是染料的浓度一般都会高一些，所以染完后都会进行离心洗涤，将未与细胞结合的染料洗掉，要是不洗的话，背景值太高，导致各个组别的差异不明显。另一种染料染完后，也要洗去多余的染料的。 你讲得先染色，再消化这个方法。我没试过，但是我觉得存下面问题： 染料进入细胞后，进行消化的话，细胞在非正常状态下，可能经受不了胰酶，胰酶消化过的话，也会对细胞膜造成损伤的，你的未染组大部分是坏死细胞，可能就是因为胰酶效果过度的问题。 建议你用先消化，后染色的方法试一下。注意消化不要过度，吹打轻柔，染料的特点都在细胞膜的通透性上，一定注意不要损伤细胞膜。 |
8楼2012-06-16 15:02:57
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-06-15 13:50:16
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我发现一个问题，楼主的细胞是先加染料，再消化。这顺序应该是相反了啊。一般都是先消化，再加染料。我查证了一下该产品说明书，确实如此。http://www.keygentec.com.cn/productdetails/168.html 希望该信息对你有帮助呀。 另外，做细胞凋亡实验，选用Annexin V-FITC/PI双染检测，更常见一些。这种试剂盒，能检测到正常细胞、早晚期凋亡细胞、坏死细胞以外，还可以反应机械性损伤的细胞，共分为为四个部分。而你所采用的试剂盒，反映出来的只有前三部分。 好了，祝你下回实验成功！ |
2楼2012-06-14 22:17:31
tonyprague1967
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3楼2012-06-14 23:18:47
tonyprague1967
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4楼2012-06-14 23:20:16
