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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

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[求助] 用Hoechst33342/PI 双染做流式，居然只检测到坏死细胞，这是个什么状况

今天做了流式，是用凯基的Hoechst33342/PI 双染试剂盒来检测细胞凋亡，但是结果出来之后发现，坏死细胞特别多，凋亡的细胞就没几颗，而且散点图显示，细胞特别分散，我不知道这是个什么原因？
我的是贴壁细胞，我是在染完之后才消化的，然后直接用培养基终止消化，吹打成单个细胞，然后去检测;在染色之前我用多聚甲醛对细胞进行了固定？那这个固定队细胞坏死有没有很大影响呢？
Hoechst33342 它可以穿过活细胞的膜，区分凋亡和正常细胞，但在我做的流式结果里，怎么没有差别呢？求指点。谢谢啊

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1楼 2012-06-14 20:26:38

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l_h_10

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

你的最关键的问题是用多聚甲醛固定了，固定之后，活细胞都变成了死细胞了。我觉得Hoechst33342/PI 双染这个试剂盒更适用于染色后在荧光显微镜下观察，我用过这个方法，在显微镜下观察。并且这个方法我们习惯是，细胞先染PI，让PI进入膜有损伤的细胞，然后多聚甲醛固定，接着染hoechst 33342，让其进入所有细胞，然后放到荧光显微镜下观察。在hoechst和PI的通道上分别拍照片，然后把照片叠加。
个人认为用流式测细胞凋亡的话，还是用AV/PI的试剂盒检测，AV染早期凋亡的细胞，PI染晚期凋亡和坏死的细胞，这个试剂盒我们一直在用。

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7楼2012-06-16 14:45:38

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查看全部 13 个回答

2011加油

银虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-06-15 13:50:16

我发现一个问题，楼主的细胞是先加染料，再消化。这顺序应该是相反了啊。一般都是先消化，再加染料。我查证了一下该产品说明书，确实如此。http://www.keygentec.com.cn/productdetails/168.html
希望该信息对你有帮助呀。

另外，做细胞凋亡实验，选用Annexin V-FITC/PI双染检测，更常见一些。这种试剂盒，能检测到正常细胞、早晚期凋亡细胞、坏死细胞以外，还可以反应机械性损伤的细胞，共分为为四个部分。而你所采用的试剂盒，反映出来的只有前三部分。

好了，祝你下回实验成功！

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每天都是新开始，2011，要好好努力！