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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接产物酶切的一点问题
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)

[求助] 连接产物酶切的一点问题

将连接产物做转化 进行菌落PCR 将PCR鉴定阳性（跑出目的基因）的菌落 提质粒
之后 做的质粒PCR（空载体做验证）都很成功 目的基因条带很亮
载体5000 目的基因800
之后进行双酶切验证 结果切出了二/三条带 有约5000、4000、2000
不明白？
是酶切 没切干净？
ECORI 2UL
XHO1 2UL
BUFFER H 4UL
模板 约1ug
ddH2O up to 40ul
37℃ 过夜

20120921
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1楼 2012-09-22 00:39:07
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
MARKER: 4000 3000 2000 1200 800 500 200
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2楼2012-09-22 00:42:42
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ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主的marker怎么只有六条带，可楼主提拱的数据是七个…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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有时候，一句话，可以改变未来
3楼2012-09-22 00:59:51
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-22 00:59:51
楼主的marker怎么只有六条带，可楼主提拱的数据是七个…

@ @  
7条 你看错了吧
…………
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4楼2012-09-22 20:18:26
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:23:27
嗯，可能你那个酶在载体上或者目的片段上还有其他的酶切位点吧？也有可能还有的没有切开，还是环状。你可以酶切之后，再跑一个质粒的，排除是不是酶切不完全的可能。
还有就是做菌落PCR时可以考虑做一个阴性对照。
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5楼2012-09-23 11:00:14
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 欢迎回来 2012-09-24 10:23:47
嗯.................
       同意楼上童鞋方针
       1. 菌落PCR一定要有NTC
       2. 质粒酶切一定要有原质粒电泳对照
       3. 钱多并且嫌麻烦就测序 给通用引物 可以测出部分载体序列的
       4. 一定要确定酶的位点数再做 说实话 个人觉得 EcoRI和XhoI都算位点出现频率中上的酶了
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
6楼2012-09-23 11:31:21
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:23:57
本帖内容被屏蔽
7楼2012-09-23 14:36:24
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by piaoyunokok at 2012-09-23 11:00:14
嗯，可能你那个酶在载体上或者目的片段上还有其他的酶切位点吧？也有可能还有的没有切开，还是环状。你可以酶切之后，再跑一个质粒的，排除是不是酶切不完全的可能。
还有就是做菌落PCR时可以考虑做一个阴性对照。

菌落PCR 有阴性对照的 跑胶出来的目的基因条带很清晰很亮。
我觉得可能是没切开。
我加大酶量 再试试
只是刚好酶切用酶没有了，周末不送货。现在在等送货，真心焦。
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8楼2012-09-24 12:07:00
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-23 11:31:21
嗯.................
       同意楼上童鞋方针
       1. 菌落PCR一定要有NTC
       2. 质粒酶切一定要有原质粒电泳对照
       3. 钱多并且嫌麻烦就测序 给通用引物 可以测出部分载体序列的
       4. 一定要 ...

呃 确实我在做质粒酶切电泳的时候 没有做空白对照 疏忽了
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9楼2012-09-24 12:09:11
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QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wcwluwei at 2012-09-23 14:36:24
lz不哭。。。
我看了下你的电泳图，你这个图基本确定应该是质粒的条带，目的条带没有切出来，首先有可能是这个质粒没有你的片段，还有可能就是你酶切时间或者体系出现问题了，找找原因。祝你成功

刚接触分子克隆
酶切系统的话 问题应该不大 是按试剂盒说明的那样做的量
不过我试试加大酶用量
另外再补个没有酶切的载体电泳做参照
这个质粒里 目的基因片段 肯定有的 因为之前用的是阳性菌落PCR 之后提质粒之后 也做了个PCR跑胶验证 效果都不错
所以应该就单是酶切本身的问题
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10楼2012-09-24 12:12:08
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