应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接产物酶切的一点问题
131/2返回列表12下一页
查看: 1684  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)

[求助] 连接产物酶切的一点问题

将连接产物做转化 进行菌落PCR 将PCR鉴定阳性（跑出目的基因）的菌落 提质粒
之后 做的质粒PCR（空载体做验证）都很成功 目的基因条带很亮
载体5000 目的基因800
之后进行双酶切验证 结果切出了二/三条带 有约5000、4000、2000
不明白？
是酶切 没切干净？
ECORI 2UL
XHO1 2UL
BUFFER H 4UL
模板 约1ug
ddH2O up to 40ul
37℃ 过夜

20120921
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-22 00:39:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
MARKER: 4000 3000 2000 1200 800 500 200
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-22 00:42:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主的marker怎么只有六条带，可楼主提拱的数据是七个…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
有时候，一句话，可以改变未来
3楼2012-09-22 00:59:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ysn5048 at 2012-09-22 00:59:51
楼主的marker怎么只有六条带，可楼主提拱的数据是七个…

@ @  
7条 你看错了吧
…………
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-22 20:18:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

piaoyunokok

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:23:27
嗯，可能你那个酶在载体上或者目的片段上还有其他的酶切位点吧？也有可能还有的没有切开，还是环状。你可以酶切之后，再跑一个质粒的，排除是不是酶切不完全的可能。
还有就是做菌落PCR时可以考虑做一个阴性对照。
赞一下 回复此楼
5楼2012-09-23 11:00:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 欢迎回来 2012-09-24 10:23:47
嗯.................
       同意楼上童鞋方针
       1. 菌落PCR一定要有NTC
       2. 质粒酶切一定要有原质粒电泳对照
       3. 钱多并且嫌麻烦就测序 给通用引物 可以测出部分载体序列的
       4. 一定要确定酶的位点数再做 说实话 个人觉得 EcoRI和XhoI都算位点出现频率中上的酶了
       个人看法 若有说错请高手指点
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
6楼2012-09-23 11:31:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcwluwei

禁虫 (小有名气)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:23:57
本帖内容被屏蔽
7楼2012-09-23 14:36:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by piaoyunokok at 2012-09-23 11:00:14
嗯，可能你那个酶在载体上或者目的片段上还有其他的酶切位点吧？也有可能还有的没有切开，还是环状。你可以酶切之后，再跑一个质粒的，排除是不是酶切不完全的可能。
还有就是做菌落PCR时可以考虑做一个阴性对照。

菌落PCR 有阴性对照的 跑胶出来的目的基因条带很清晰很亮。
我觉得可能是没切开。
我加大酶量 再试试
只是刚好酶切用酶没有了，周末不送货。现在在等送货，真心焦。
赞一下 回复此楼
8楼2012-09-24 12:07:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-23 11:31:21
嗯.................
       同意楼上童鞋方针
       1. 菌落PCR一定要有NTC
       2. 质粒酶切一定要有原质粒电泳对照
       3. 钱多并且嫌麻烦就测序 给通用引物 可以测出部分载体序列的
       4. 一定要 ...

呃 确实我在做质粒酶切电泳的时候 没有做空白对照 疏忽了
赞一下 回复此楼
9楼2012-09-24 12:09:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QUENIX2321

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wcwluwei at 2012-09-23 14:36:24
lz不哭。。。
我看了下你的电泳图，你这个图基本确定应该是质粒的条带，目的条带没有切出来，首先有可能是这个质粒没有你的片段，还有可能就是你酶切时间或者体系出现问题了，找找原因。祝你成功

刚接触分子克隆
酶切系统的话 问题应该不大 是按试剂盒说明的那样做的量
不过我试试加大酶用量
另外再补个没有酶切的载体电泳做参照
这个质粒里 目的基因片段 肯定有的 因为之前用的是阳性菌落PCR 之后提质粒之后 也做了个PCR跑胶验证 效果都不错
所以应该就单是酶切本身的问题
赞一下 回复此楼
10楼2012-09-24 12:12:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 QUENIX2321 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-30 07:50 by winsaint
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 06:43 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 06:22 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 10/500 2026-08-30 06:11 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 06:02 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 11/550 2026-08-30 06:00 by ZPa0EcMwuECS
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 13/650 2026-08-30 05:38 by ZPa0EcMwuECS
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +7 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-30 01:14 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-30 01:03 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-30 00:52 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭