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求助-Sac1和Spe1的双酶切连接
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我在做Sac1和Spe1的双酶切连接（有人说Sac1不好切也有人说Spe1不好切，不知对不对？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约10k，目的片段1100bp）,测浓度都是40纳克/微升左右，然后做连接（16度过夜和4度过夜都尝试过），共15微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;1.5微升10×连接buffer，也换过新的; 大片段5微升，目的片段7.5微升，两者的摩尔比在1:3-1:10的范围内），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-21 at 11:46 ] |
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连接产物太大了，不太好连，不过我也连过这么大的，还是长了，你可以4摄氏度周五晚上连好，放到周一转，我那感受态效率还不大好，都长了很多，阳性率80-90%，注意最好转DH这种不表达蛋白的菌，别直接就转BL表达菌了，然后回收后的条带，你跑个胶看看，有没条带，有时候测的不太准 注：因为我感受态效率一般，我连过夜那个也长不了几个，不过幸好是阳性，另外新的也不一定好用，反正我觉得NEB的比宝生物的好用，我用宝生物的酶长的不多 |
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