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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助-Sac1和Spe1的双酶切连接
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33ggdf

新虫 (小有名气)

[求助] 求助-Sac1和Spe1的双酶切连接

我在做Sac1和Spe1的双酶切连接（有人说Sac1不好切也有人说Spe1不好切，不知对不对？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约10k，目的片段1100bp）,测浓度都是40纳克/微升左右，然后做连接（16度过夜和4度过夜都尝试过），共15微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;1.5微升10×连接buffer，也换过新的; 大片段5微升，目的片段7.5微升，两者的摩尔比在1:3-1:10的范围内），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？

[ Last edited by 1949stone on 2013-8-21 at 11:46 ]
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1楼 2013-08-20 09:48:03
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回帖置顶 ( 共有2个 )

sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-20 11:31:15
amisking: 回帖置顶 2013-08-20 18:03:53
感觉大片段加太多了呀，但我不知道大片段的浓度，只是潜意识觉得大片段的浓度都比目的片段要高很多。
可以试试大片段1ul，目的片段7ul，连接酶和buffer分别1ul的体系，或者把上述体系加倍的20ul体系。一般16℃过夜就可以，但是担心温度不准的话在PCR仪上设16℃也可以
另外不知道两个酶切出来是平末端还是粘性末端~
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33ggdf
你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2013-08-20 11:29:34
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pearsir

新虫 (初入文坛)

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33ggdf: 金币+2 2013-08-21 10:18:55
1949stone: 回帖置顶 2013-08-21 11:46:36
一个菌落都没长，首先说明楼主载体酶切完全了，表达载体和克隆片段的酶切又都条带合适；最大的问题就是连接了，因为你阳性对照肯定不是拿连接产物做的吧。
建议：
1.更换（借别人的）连接酶和buffer；
2.目的片段对载体的摩尔比增加到1：10~1：15.
祝好运哈！
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9楼2013-08-20 23:05:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-20 11:31:02
33ggdf: 金币+2 2013-08-20 15:52:33
弄几个不同比例的（适当提高目的片段的量）同时连接、转化，加大反应体系，16度连接过夜后，转一批，其余的连接产物4度继续连，8~12h后再转一批，24h再转。
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岂能尽如人意，但求无愧我心
2楼2013-08-20 10:54:40
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-08-20 11:31:09
连接产物太大了，不太好连，不过我也连过这么大的，还是长了，你可以4摄氏度周五晚上连好，放到周一转，我那感受态效率还不大好，都长了很多，阳性率80-90%，注意最好转DH这种不表达蛋白的菌，别直接就转BL表达菌了，然后回收后的条带，你跑个胶看看，有没条带，有时候测的不太准
注：因为我感受态效率一般，我连过夜那个也长不了几个，不过幸好是阳性，另外新的也不一定好用，反正我觉得NEB的比宝生物的好用，我用宝生物的酶长的不多
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33ggdf
3楼2013-08-20 11:24:34
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33ggdf

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by sxxuan at 2013-08-20 11:29:34
感觉大片段加太多了呀，但我不知道大片段的浓度，只是潜意识觉得大片段的浓度都比目的片段要高很多。
可以试试大片段1ul，目的片段7ul，连接酶和buffer分别1ul的体系，或者把上述体系加倍的20ul体系。一般16℃过夜 ...

大片段和小片段的量是根据摩尔比算出来的，大片段的浓度是41.4 小片段的浓度是32.7,。这两个酶切出来的是都是粘性末端，
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5楼2013-08-20 15:40:41
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33ggdf

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-08-20 11:24:34
连接产物太大了，不太好连，不过我也连过这么大的，还是长了，你可以4摄氏度周五晚上连好，放到周一转，我那感受态效率还不大好，都长了很多，阳性率80-90%，注意最好转DH这种不表达蛋白的菌，别直接就转BL表达菌了 ...

最好转DH这种不表达蛋白的菌，别直接就转BL表达菌了，请问DB3.1属于哪一种
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6楼2013-08-20 15:47:32
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-20 18:28:08
两点
1. 提高连接的效率（可以考虑低温，长时间， 也可以尝试增加片段的浓度）
2. 提高感受态的转化效率（可以考虑买，一般商品化的都标称10的8次方cfu/ug, 也可以参考分子克隆上高效率感受态的制备方法自制，如inoue法）
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7楼2013-08-20 15:49:08
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-20 15:40:41
大片段和小片段的量是根据摩尔比算出来的，大片段的浓度是41.4 小片段的浓度是32.7,。这两个酶切出来的是都是粘性末端，...

按你说的这个浓度，大片段比小片段几乎是1:1了呀
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你的日子如何，你的力量也必如何！
8楼2013-08-20 15:57:12
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stfoxst

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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33ggdf: 金币+2 2013-08-21 10:14:05
33ggdf: 金币+2 2013-08-21 10:19:20
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-22 00:05:51
按楼主的说法，理论上讲双酶切应该是完全的，否则会有自连的质粒。应该是连接的问题。
给楼主一个建议，在连接之前把vector和insert混合，60-65℃，5min，冷却，离心，然后加酶和buffer
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
10楼2013-08-21 00:06:15
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