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33ggdf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by stfoxst at 2013-08-21 00:06:15
按楼主的说法,理论上讲双酶切应该是完全的,否则会有自连的质粒。应该是连接的问题。
给楼主一个建议,在连接之前把vector和insert混合,60-65℃,5min,冷却,离心,然后加酶和buffer

请问这一步的作用是??
11楼2013-08-21 10:13:57
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stfoxst

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-08-22 00:06:03
引用回帖:
11楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-21 10:13:57
请问这一步的作用是??...

回收的片段的粘性末端有时会连在一起,加热可以把vector-vector和insert-insert连接断开,从新退火后vector-insert的正确连接比例显著提升。
你的表达载体(10kb)很大,串联起来至少是20kb,就算有自连也超过了细菌质粒的上限,所以你的平板连自连的菌落也没有。
当然这只是推测,需要你实验验证一下。做完后,不管结果好不好,请在这里给个反馈,也能为大家提供借鉴。

这是我以前发的帖子,有详细的解释。http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6254162
AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
12楼2013-08-21 11:25:03
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-08-22 00:06:12
照楼主的描述,问题应该出在酶连上,除了考虑连接酶和buffer的问题,适当改变一下片段的加量,载体片段:目的片段控制在1:3~1:10,主要是要按照连接酶说明书上的要求加量。
做自己
13楼2013-08-21 14:35:36
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lianfeng1107

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-08-22 00:06:17
33ggdf: 金币+2 2013-08-22 07:41:23
LZ可以在连接后,取3-5微升的连接产物跑下胶,看有没有连接上去再去做转化,这样就可以看是不是连接上出了问题了。LZ的片段也不算大,我之前连的片段都在1.6KB左右,都还算好连。
14楼2013-08-21 23:35:30
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