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33ggdf

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引用回帖:

10楼: Originally posted by stfoxst at 2013-08-21 00:06:15
按楼主的说法，理论上讲双酶切应该是完全的，否则会有自连的质粒。应该是连接的问题。
给楼主一个建议，在连接之前把vector和insert混合，60-65℃，5min，冷却，离心，然后加酶和buffer

请问这一步的作用是？？

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11楼2013-08-21 10:13:57

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stfoxst

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-22 00:06:03

引用回帖:

11楼: Originally posted by 33ggdf at 2013-08-21 10:13:57
请问这一步的作用是？？...

回收的片段的粘性末端有时会连在一起，加热可以把vector-vector和insert-insert连接断开，从新退火后vector-insert的正确连接比例显著提升。
你的表达载体（10kb）很大，串联起来至少是20kb，就算有自连也超过了细菌质粒的上限，所以你的平板连自连的菌落也没有。
当然这只是推测，需要你实验验证一下。做完后，不管结果好不好，请在这里给个反馈，也能为大家提供借鉴。

这是我以前发的帖子，有详细的解释。http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6254162

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