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求助-Sac1和Spe1的双酶切连接
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我在做Sac1和Spe1的双酶切连接（有人说Sac1不好切也有人说Spe1不好切，不知对不对？），分别用这两个酶对表达载体和T载体进行双酶切过夜（NEB的酶 标注说过夜不会产生星活性），T载体上我还加了保护碱基，然后分别切胶回收表达载体的大片段和T载体上的目的片段（两个片段都很亮，大小也合适，大片段约10k，目的片段1100bp）,测浓度都是40纳克/微升左右，然后做连接（16度过夜和4度过夜都尝试过），共15微升体系（1微升连接酶，连接酶我用的是新的;1.5微升10×连接buffer，也换过新的; 大片段5微升，目的片段7.5微升，两者的摩尔比在1:3-1:10的范围内），再进行热击转化涂皿，分别做了阳性对照（很多单菌落）和阴性对照（无单菌落）可以证明感受态及转化过程没问题，双酶切也成功。可为什么我的连接反应却一个单菌落也长不出来呢（抗性和浓度也没问题），哪位高人帮帮忙？？？ [ Last edited by 1949stone on 2013-8-21 at 11:46 ] |
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10楼2013-08-21 00:06:15
【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-22 00:06:03
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-22 00:06:03
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回收的片段的粘性末端有时会连在一起，加热可以把vector-vector和insert-insert连接断开，从新退火后vector-insert的正确连接比例显著提升。 你的表达载体（10kb）很大，串联起来至少是20kb，就算有自连也超过了细菌质粒的上限，所以你的平板连自连的菌落也没有。 当然这只是推测，需要你实验验证一下。做完后，不管结果好不好，请在这里给个反馈，也能为大家提供借鉴。 这是我以前发的帖子，有详细的解释。http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6254162 |
12楼2013-08-21 11:25:03