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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切很近的酶切位点，总是切不成功，如何解决？
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gookies

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切很近的酶切位点，总是切不成功，如何解决？ 已有6人参与

实验需要将已有的载体进行双酶切，再插入一段片段。

由于只能插入到多克隆位点上，所以酶切位点的选择有限，只能选择靠得很近的两个酶切位点，序列是：
GACGTCGGATCCGAATTCGGTACC
需要切的是GACGTC（Aat II）和GGTACC（Kpn I）

之前用的TAKARA的酶，由于Buffer不同，分步酶切，但是效率一直很低，得不到最终的双酶切。
后来用NEB的酶，使用的是Aat II 和 Kpn I HF快切酶。
然后回收（回收浓度也非常低，0.004~0.015（ug/ul）之间），与目的片段连接。
由于插入片段的目的是为了破坏氨苄的抗性，同时载体本身具有卡纳的抗性。
所以转化之后，先用卡纳平板筛选， 挑斑到卡纳液体LB中，摇浑后再取部分在amp液体LB中培养，想着amp不浑浊的就是插入了片段的。

可是挑了几十个斑，都是两种抗性都有，随机挑了两个进行测序，发现目的片段压根就没有插入。

中间换了新酶切后的插入片段进行连接，仍然没有成功。

又做了一次双酶切，回收条带也非常浅。

是要再多次做一下双酶切嘛？（因为第一次有六个载体同时做双酶切，但是又试了两个进行连接，也都没有连接上）

不知道有什么方法可以更好地进行双酶切？

求大神醍醐灌顶。。。
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1楼 2015-12-16 22:25:18
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shanyue00

铁杆木虫 (著名写手)
你这酶平时的酶切效率高么？

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耐心说话，好好说话！
2楼2015-12-16 23:14:13
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shanyue00 at 2015-12-16 23:14:13
你这酶平时的酶切效率高么？

还是挺高的，另外一个目的片段切的就比较好
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5楼2015-12-18 09:46:38
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shanyue00

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币-3, 应助指数-1, 请勿刷应助指数，谢谢你的理解与配合。 2015-12-18 12:35:32
你们载体酶切之后会加防止载体自连的东西么？
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7楼2015-12-18 10:25:59
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普通回帖

tiaojihaizi

银虫 (小有名气)
双酶切距离太近效果就是不好，实在不行建议重新设计

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3楼2015-12-17 00:12:36
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逸萧菲尔

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-12-18 12:35:12
1.酶切位点很近的话不建议用快酶。
2.分别切开，一次切一个，总共切两次，
3.每次切的时间要充分。保证每次都充分的切开
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4楼2015-12-17 16:19:09
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shanyue00

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gookies at 2015-12-18 09:46:38
还是挺高的，另外一个目的片段切的就比较好...

增大酶切体系
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6楼2015-12-18 10:20:42
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by shanyue00 at 2015-12-18 10:25:59
你们载体酶切之后会加防止载体自连的东西么？

好像没有加，直接用的sollution I
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8楼2015-12-19 11:00:56
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shanyue00 at 2015-12-18 10:20:42
增大酶切体系...

我用的是50ul的体系。之前目的片段用0.5的酶就切出来了，这个载体的体系各加了1ul的酶，切的片段不知道怎么确定是不是要的片段。
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9楼2015-12-19 11:02:10
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
切的模板量太少了吧？建议要个20ml的菌液把模板量加大到5ug左右再去做酶切
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。
10楼2015-12-19 12:17:39
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