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玻璃花1

金虫 (小有名气)

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[求助] 基因敲除质粒PKD46质粒酶切位点选择已有2人参与

最近想利用同源重组的方法做一个阴性菌的基因敲除，找到了PKD46这个质粒，但对其酶切位点分析，我可以利用的双酶切位点好少，一种选择是Drd I/Sap I/Bst E II三选一，但这三种酶不是常用酶，没有共用Buffer,网上说其酶切效果不稳定（不好）；第二种选择是EcoICRI 和SacI,但这两个酶切位点靠的很近很近，没法切。。。
但是文献报道中，PKD46用的很多，想问问酶切位点是怎么选的？

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1楼 2015-04-18 22:01:27

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暗红柳绿

铁虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

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玻璃花1: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-08-24 14:03:26

可以用pKD46质粒里面的酶切位点，用你们实验室已经有的限制性内切酶做个酶切。多做几种，有单酶切，也有双酶切甚至3酶切，不一定要单酶切位点的酶。
没有酶切位点的也可以试试，如果能切开，那就说明质粒有问题。

(  1) BamHI    : GGATCC             : 1 Sites
   1155- 1154:  6329 base

( 2) EcoRI    : GAATTC             : 2 Sites
   2725- 1215:  4820 base
   1216- 2724:  1509 base

( 3) EcoRV    : GATATC             : 1 Sites
   302-  301:  6329 base

( 4) NcoI    : CCATGG             : 1 Sites
   3390- 3389:  6329 base

( 5) NotI    : GCGGCCGC          : 1 Sites
   4834- 4833:  6329 base

( 5) PstI    : CTGCAG             : 2 Sites
   2471- 2223:  6082 base
   2224- 2470: 247 base

( 6) SacI    : GAGCTC             : 1 Sites
   1226- 1225:  6329 base

( 7) SalI    : GTCGAC             : 1 Sites
   1727- 1726:  6329 base

( 8) SpeI    : ACTAGT             : 1 Sites
   4514- 4513:  6329 base

没有酶切位点的：
HindIII KpnI    NdeI    NheI
SfiI    XbaI    XhoI