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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除质粒PKD46质粒酶切位点选择
汕头大学海洋科学接受调剂
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玻璃花1

金虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除质粒PKD46质粒酶切位点选择 已有2人参与

最近想利用同源重组的方法做一个阴性菌的基因敲除，找到了PKD46这个质粒，但对其酶切位点分析，我可以利用的双酶切位点好少，一种选择是Drd I/Sap I/Bst E II三选一，但这三种酶不是常用酶，没有共用Buffer,网上说其酶切效果不稳定（不好）；第二种选择是EcoICRI 和SacI,但这两个酶切位点靠的很近很近，没法切。。。
但是文献报道中，PKD46用的很多，想问问酶切位点是怎么选的？
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1楼 2015-04-18 22:01:27
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暗红柳绿

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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玻璃花1: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-08-24 14:03:26
可以用pKD46质粒里面的酶切位点，用你们实验室已经有的限制性内切酶做个酶切。多做几种，有单酶切，也有双酶切甚至3酶切，不一定要单酶切位点的酶。
没有酶切位点的也可以试试，如果能切开，那就说明质粒有问题。

(  1) BamHI     : GGATCC               :   1 Sites
      1155- 1154:  6329 base

( 2) EcoRI     : GAATTC               :   2 Sites
      2725- 1215:  4820 base
      1216- 2724:  1509 base

( 3) EcoRV     : GATATC               :   1 Sites
       302-  301:  6329 base

( 4) NcoI      : CCATGG               :   1 Sites
      3390- 3389:  6329 base

( 5) NotI      : GCGGCCGC             :   1 Sites
      4834- 4833:  6329 base

( 5) PstI      : CTGCAG               :   2 Sites
      2471- 2223:  6082 base
      2224- 2470:   247 base

( 6) SacI      : GAGCTC               :   1 Sites
      1226- 1225:  6329 base

( 7) SalI      : GTCGAC               :   1 Sites
      1727- 1726:  6329 base

( 8) SpeI      : ACTAGT               :   1 Sites
      4514- 4513:  6329 base

没有酶切位点的：
HindIII    KpnI       NdeI       NheI      
SfiI       XbaI       XhoI
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2楼2015-07-30 19:21:21
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红塔山和云烟

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不知道你为什么要酶切pKD46质粒，在敲除基因的时候这个质粒只是用来表达三个重组酶的，并不要进行酶切。
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玻璃花1
3楼2015-08-04 11:20:31
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玻璃花1

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 红塔山和云烟 at 2015-08-04 11:20:31
不知道你为什么要酶切pKD46质粒，在敲除基因的时候这个质粒只是用来表达三个重组酶的，并不要进行酶切。

是的，当时没搞明白，后来并没用这样的方式
赞一下 回复此楼
4楼2015-08-24 14:05:06
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