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基因敲除质粒PKD46质粒酶切位点选择已有2人参与
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最近想利用同源重组的方法做一个阴性菌的基因敲除，找到了PKD46这个质粒，但对其酶切位点分析，我可以利用的双酶切位点好少，一种选择是Drd I/Sap I/Bst E II三选一，但这三种酶不是常用酶，没有共用Buffer,网上说其酶切效果不稳定（不好）；第二种选择是EcoICRI 和SacI,但这两个酶切位点靠的很近很近，没法切。。。 但是文献报道中，PKD46用的很多，想问问酶切位点是怎么选的？ |
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【答案】应助回帖
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玻璃花1: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-08-24 14:03:26
玻璃花1: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-08-24 14:03:26
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可以用pKD46质粒里面的酶切位点，用你们实验室已经有的限制性内切酶做个酶切。多做几种，有单酶切，也有双酶切甚至3酶切，不一定要单酶切位点的酶。 没有酶切位点的也可以试试，如果能切开，那就说明质粒有问题。 ( 1) BamHI : GGATCC : 1 Sites 1155- 1154: 6329 base ( 2) EcoRI : GAATTC : 2 Sites 2725- 1215: 4820 base 1216- 2724: 1509 base ( 3) EcoRV : GATATC : 1 Sites 302- 301: 6329 base ( 4) NcoI : CCATGG : 1 Sites 3390- 3389: 6329 base ( 5) NotI : GCGGCCGC : 1 Sites 4834- 4833: 6329 base ( 5) PstI : CTGCAG : 2 Sites 2471- 2223: 6082 base 2224- 2470: 247 base ( 6) SacI : GAGCTC : 1 Sites 1226- 1225: 6329 base ( 7) SalI : GTCGAC : 1 Sites 1727- 1726: 6329 base ( 8) SpeI : ACTAGT : 1 Sites 4514- 4513: 6329 base 没有酶切位点的： HindIII KpnI NdeI NheI SfiI XbaI XhoI |
2楼2015-07-30 19:21:21
玻璃花13楼2015-08-04 11:20:31
4楼2015-08-24 14:05:06