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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » pKD46质粒的提取问题
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joker1

银虫 (小有名气)

[求助] pKD46质粒的提取问题 已有2人参与

本人前不久从公司购买含pKD46质粒的细菌进行质粒提取，可用天根质粒提取试剂盒提出的质粒跑电泳6329 bp的pKD46质粒跑在10000bp左右位置。公司解释说是该质粒比较难提，可能是提到的质粒不是超螺旋状态、电泳问题等等（公司提供的质粒电泳图在5000bp左右）。后来按照公司的指导加抗性培养，缩短培养时间多次提取还是没有什么改变。有没有人从网上购买含pKD46质粒的细菌并进行质粒提取啊？关于比较难提取的质粒的相关技术指导资料有哪些?谢谢了！
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心不开，话不来。
1楼 2015-03-05 11:46:10
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Jatropha

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
joker1: 金币+30, ★★★很有帮助 2015-03-14 12:15:35
你确认用的超螺旋（也就是质粒）marker吗？TaKaRa公式有超螺旋marker，我超喜欢用。
如果不是，建议用超螺旋marker。

还有一个办法，是做一个单酶切，然后用普通的marker检测质粒的大小。

跑质粒，用普通的marker，质粒的位置随着胶浓度的不同和电泳时间的不同，位置是不一样的。
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2楼2015-03-14 09:19:22
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Jatropha

银虫 (初入文坛)
另外，pKD46质粒我的实验也很需要。
你能把含pKD46质粒的菌寄个我一份吗？
万分感激！
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3楼2015-03-14 09:22:04
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一砖头飘死

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
joker1: 金币+30, ★★★很有帮助 2015-03-14 12:15:47
如果你用的事Takara的普通的maraker的话，6329bp的质粒在10000bp有条带也很正常，因为一般试剂盒提取到的质粒有三种形态：超螺旋、闭合环状中间体，还有一个记得不太清楚了，你可以去网上搜搜看。个人建议，鉴定质粒是不是你要的质粒的话，还是找几个酶切下，也就几个小时来验证，最靠谱的。pkd46我们实验室也是从公司买的，提的时候也没啥问题呀^
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4楼2015-03-14 09:34:43
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joker1

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 一砖头飘死 at 2015-03-14 09:34:43
如果你用的事Takara的普通的maraker的话，6329bp的质粒在10000bp有条带也很正常，因为一般试剂盒提取到的质粒有三种形态：超螺旋、闭合环状中间体，还有一个记得不太清楚了，你可以去网上搜搜看。个人建议，鉴定质粒 ...

不是10000bp有条带，而是提的质粒只有在10000bp以上的一条带；我在网上查看别人提的pKD46质粒跑的条带和公司提供的电泳图都在5000bp左右。另外，我用Pst I 酶切后感觉两者大小都差不多。
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心不开，话不来。
5楼2015-03-14 12:16:06
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joker1

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Jatropha at 2015-03-14 09:22:04
另外，pKD46质粒我的实验也很需要。
你能把含pKD46质粒的菌寄个我一份吗？
万分感激！

我还在确认这个质粒对不对
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心不开，话不来。
6楼2015-03-14 12:21:24
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Jatropha

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by joker1 at 2015-03-14 12:21:24
我还在确认这个质粒对不对...

最快的方法是用pKD46质粒里面的酶切位点，用你们实验室已经有的限制性内切酶做个酶切。多做几种，有单酶切，也有双酶切甚至3酶切。
没有酶切位点的也可以试试，如果能切开，那就说明质粒有问题。

(  1) BamHI     : GGATCC               :   1 Sites
      1155- 1154:  6329 base

( 2) EcoRI     : GAATTC               :   2 Sites
      2725- 1215:  4820 base
      1216- 2724:  1509 base

( 3) EcoRV     : GATATC               :   1 Sites
       302-  301:  6329 base

( 4) NcoI      : CCATGG               :   1 Sites
      3390- 3389:  6329 base

( 5) NotI      : GCGGCCGC             :   1 Sites
      4834- 4833:  6329 base

( 5) PstI      : CTGCAG               :   2 Sites
      2471- 2223:  6082 base
      2224- 2470:   247 base

( 6) SacI      : GAGCTC               :   1 Sites
      1226- 1225:  6329 base

( 7) SalI      : GTCGAC               :   1 Sites
      1727- 1726:  6329 base

( 8) SpeI      : ACTAGT               :   1 Sites
      4514- 4513:  6329 base

没有酶切位点的：
HindIII    KpnI       NdeI       NheI      
SfiI       XbaI       XhoI
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7楼2015-03-15 08:21:09
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Jatropha

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 一砖头飘死 at 2015-03-14 09:34:43
如果你用的事Takara的普通的maraker的话，6329bp的质粒在10000bp有条带也很正常，因为一般试剂盒提取到的质粒有三种形态：超螺旋、闭合环状中间体，还有一个记得不太清楚了，你可以去网上搜搜看。个人建议，鉴定质粒 ...

个人的经验，看质粒大小还是用TaKaRa的超螺旋marker，以我们提的质粒最前面的一条带（超螺旋）为准。

我的实验现在也很需要pKD46质粒，不知道您是否方便给我一份。
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8楼2015-03-15 08:24:55
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joker1

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Jatropha at 2015-03-15 08:24:55
个人的经验，看质粒大小还是用TaKaRa的超螺旋marker，以我们提的质粒最前面的一条带（超螺旋）为准。

我的实验现在也很需要pKD46质粒，不知道您是否方便给我一份。...

如果真的需要的话我可以把摇的菌液给你一份。
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心不开，话不来。
9楼2015-03-15 19:26:20
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joker1

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Jatropha at 2015-03-15 08:21:09
最快的方法是用pKD46质粒里面的酶切位点，用你们实验室已经有的限制性内切酶做个酶切。多做几种，有单酶切，也有双酶切甚至3酶切。
没有酶切位点的也可以试试，如果能切开，那就说明质粒有问题。

(  1) BamHI  ...

降低胶的浓度，提的质粒跑的条带一下就到5000bp左右了，酶切还没怎么做。
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心不开，话不来。
10楼2015-03-15 19:31:00
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