| 查看: 6262 | 回复: 19 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
双酶切很近的酶切位点，总是切不成功，如何解决？ 已有6人参与
|
||
|
实验需要将已有的载体进行双酶切，再插入一段片段。 由于只能插入到多克隆位点上，所以酶切位点的选择有限，只能选择靠得很近的两个酶切位点，序列是： GACGTCGGATCCGAATTCGGTACC 需要切的是GACGTC（Aat II）和GGTACC（Kpn I） 之前用的TAKARA的酶，由于Buffer不同，分步酶切，但是效率一直很低，得不到最终的双酶切。 后来用NEB的酶，使用的是Aat II 和 Kpn I HF快切酶。 然后回收（回收浓度也非常低，0.004~0.015（ug/ul）之间），与目的片段连接。 由于插入片段的目的是为了破坏氨苄的抗性，同时载体本身具有卡纳的抗性。 所以转化之后，先用卡纳平板筛选， 挑斑到卡纳液体LB中，摇浑后再取部分在amp液体LB中培养，想着amp不浑浊的就是插入了片段的。 可是挑了几十个斑，都是两种抗性都有，随机挑了两个进行测序，发现目的片段压根就没有插入。 中间换了新酶切后的插入片段进行连接，仍然没有成功。 又做了一次双酶切，回收条带也非常浅。 是要再多次做一下双酶切嘛？（因为第一次有六个载体同时做双酶切，但是又试了两个进行连接，也都没有连接上） 不知道有什么方法可以更好地进行双酶切？ 求大神醍醐灌顶。。。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有100人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因敲除质粒PKD46质粒酶切位点选择
已经有3人回复
- 连接载体相关
已经有25人回复
- 载体与片段连不上
已经有13人回复
- BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题
已经有11人回复
- PBI121载体酶切后回收
已经有28人回复
- 分步双酶切
已经有19人回复
- （侯氏出品）双酶切连接反应之全攻略
已经有89人回复
- 影响酶切的几个主要因素
已经有13人回复
- 【转帖】PCR污染与对策
已经有9人回复
- 基因克隆与亚克隆
已经有1人回复
4楼2015-12-17 16:19:09
shanyue00
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 6765.6
- 散金: 1750
- 红花: 11
- 沙发: 1
- 帖子: 2493
- 在线: 308.5小时
- 虫号: 3323671
- 注册: 2014-07-15
- 专业: 教学论
2楼2015-12-16 23:14:13
tiaojihaizi
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 249.4
- 红花: 1
- 帖子: 82
- 在线: 18.4小时
- 虫号: 3045734
- 注册: 2014-03-13
- 专业: 植物生理与生化
3楼2015-12-17 00:12:36
5楼2015-12-18 09:46:38
