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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 分步双酶切
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混水小虫

金虫 (小有名气)

[求助] 分步双酶切

对质粒进行Hind III 和Sal I双酶切，因两个酶切位点离的太近（中间10个bp），请问是否应该采用分步酶切啊？
还有就是如果采用双酶切，这两个酶的酶切顺序如何确定啊？
在第一次酶切后，是不是必须要进行去磷酸化处理？看到之前的帖子上，说关于分步酶切中间的纯化步骤中，很多同学都没有说去磷酸化处理这个环节，是不是这一环节可以省略啊？
纯化方法哪个较好些啊？有些同学说是要电泳再割胶回收，有的说不电泳直接乙醇沉淀法回收，也有的人说不电泳直接加入溶胶buffer，开始回收！
请熟知这一方面的大虾给点帮助吧！
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1楼2012-11-29 21:16:54
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
10bp不短，注意SalI这个酶不怎么好用，多切一会吧
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4楼2012-11-29 22:41:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分步双酶切没有问题。10bp的话酶切效率应该是没问题的，那个先切都可以。两个酶之间不用磷酸酶处理。你可以做切胶回收，但没什么必要。如果保证切好了可以直接乙醇沉淀。还有更简单的办法，先用HindIII/NEB buffer2切，然后加入1/50V的2.5M NaCl （使盐浓度达到NEB buffer3）, 加入SalI切。省去回收步骤，既节约时间，又减少回收的损失。
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5楼2012-11-30 06:52:59
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
直接双酶切，怕切不开的话，过夜切，之后乙醇沉淀法就可以了，我一直都是这么做的.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
9楼2012-11-30 09:46:22
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不用，只要buffer能一起用就行了，相隔10个bp足够了~
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10楼2012-11-30 09:54:33
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 混水小虫 at 2012-11-30 09:55:57
但是我的这两个酶切位点离的比较近（10bp），按照你说的这个方法：酶切过夜。我的这个情况，可以吗？...

可以啊，我之前两个酶切位点也才距离10几个bp，没出什么问题.
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12楼2012-11-30 10:04:53
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-30 21:02:43
楼主，我帮你查了一下，一般载体的多克隆位点区域中，SalI与HindIII的识别位点差距都在15个bp以上，同时翻阅酶的说明书，查得一般10bp以上的双酶切不存在同时双切效率损失的问题，一般甚至4bp以上的距离都能保持50%以上的酶切效率，大部分切不开的都是2bp以内滴。
然后是酶切中就应该同时加上去磷酸化酶，保证所有切口都应该去磷酸话（这对于防止质粒自连至关重要，俺们实验室这么多年的分子实验传统，大部分假阳性都来源于没有去磷酸！）
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13楼2012-11-30 10:16:57
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看看takara的这两个酶，能不能双酶切，如果能的话，过夜酶切。我以前就隔5bp都用了，没问题。另外你可以用两个酶分别单酶切，确定酶能用，保证能用之后，再双酶切。
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14楼2012-11-30 11:03:07
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混水小虫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-30 10:16:57
楼主，我帮你查了一下，一般载体的多克隆位点区域中，SalI与HindIII的识别位点差距都在15个bp以上，同时翻阅酶的说明书，查得一般10bp以上的双酶切不存在同时双切效率损失的问题，一般甚至4bp以上的距离都能保持50% ...

谢谢你的解答。那按照你所说，在酶切中同时加上去磷酸化酶，进行酶切。这是对双酶切吗？双酶切没有必要加吧？
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期待，美好的生活！！
15楼2012-11-30 11:58:16
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 混水小虫 at 2012-11-30 11:58:16
谢谢你的解答。那按照你所说，在酶切中同时加上去磷酸化酶，进行酶切。这是对双酶切吗？双酶切没有必要加吧？...

我的意思是，不管你的SalI 和 HindIII是否相互影响，去磷酸化酶都是必须加的——即这里应该是三酶切！
顺便提一下去磷酸只是针对质粒，PCR片段就不需要了。
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17楼2012-11-30 15:06:44
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czdaeq

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 混水小虫 at 2012-11-30 11:58:16
谢谢你的解答。那按照你所说，在酶切中同时加上去磷酸化酶，进行酶切。这是对双酶切吗？双酶切没有必要加吧？...

哦，我明白你的意思了，你以为双酶切切掉了一部分，就不用去磷酸化了？
但是实际上你的后续纯化步骤中并没有把切掉的部分去除掉，在酶连的时候，还是会发生自连的。
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18楼2012-11-30 15:08:54
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感觉回收两次样品损失太多，先试试双酶切呗，多切一会试试，我的相隔33bp切开了。再说就不能换换酶切位点吗？
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2楼2012-11-29 21:58:32
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ben1147

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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10个bp不短了，不用分步，直接一次双酶切

双酶切载体不会自连，不用去磷酸化
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3楼2012-11-29 22:35:54
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混水小虫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 天空2011 at 2012-11-29 21:58:32
感觉回收两次样品损失太多，先试试双酶切呗，多切一会试试，我的相隔33bp切开了。再说就不能换换酶切位点吗？

首先感谢你的回复！这两个酶切位点时固定的，不能改换了。双酶切已经试了好多次了，每次连接转化后，总是出现假阳性现象。现在初步判断为质粒双酶切没有切开，所以才考虑进行分步酶切的！
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6楼2012-11-30 09:05:25
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混水小虫

金虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-29 22:41:57
10bp不短，注意SalI这个酶不怎么好用，多切一会吧

我双酶切 切了好几次了。一般都是酶切6个小时。可最后连接转化后，总是出现假阳性的现象！很是郁闷啊！！
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7楼2012-11-30 09:06:36
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混水小虫

金虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-30 06:52:59
分步双酶切没有问题。10bp的话酶切效率应该是没问题的，那个先切都可以。两个酶之间不用磷酸酶处理。你可以做切胶回收，但没什么必要。如果保证切好了可以直接乙醇沉淀。还有更简单的办法，先用HindIII/NEB buffer2 ...

忘了说了，我用的酶时宝生物的酶。如果按照你说的那个简单的办法，在第一次酶切后，直接补加缓冲液，以满足第二次酶切的需要，再加第二次酶切所用的酶，那么问题来了，因为此时载体只进行了单酶切，在第二次酶切开始之前，载体会不会自连啊？
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8楼2012-11-30 09:09:58
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