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11楼2012-11-30 09:55:57

Marado

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11楼: Originally posted by 混水小虫 at 2012-11-30 09:55:57
但是我的这两个酶切位点离的比较近（10bp），按照你说的这个方法：酶切过夜。我的这个情况，可以吗？...

可以啊，我之前两个酶切位点也才距离10几个bp，没出什么问题.

Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?

12楼2012-11-30 10:04:53

czdaeq

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★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-30 21:02:43

楼主，我帮你查了一下，一般载体的多克隆位点区域中，SalI与HindIII的识别位点差距都在15个bp以上，同时翻阅酶的说明书，查得一般10bp以上的双酶切不存在同时双切效率损失的问题，一般甚至4bp以上的距离都能保持50%以上的酶切效率，大部分切不开的都是2bp以内滴。
然后是酶切中就应该同时加上去磷酸化酶，保证所有切口都应该去磷酸话（这对于防止质粒自连至关重要

，俺们实验室这么多年的分子实验传统，大部分假阳性都来源于没有去磷酸！）

13楼2012-11-30 10:16:57

wangqi20092

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感谢参与，应助指数 +1

看看takara的这两个酶，能不能双酶切，如果能的话，过夜酶切。我以前就隔5bp都用了，没问题。另外你可以用两个酶分别单酶切，确定酶能用，保证能用之后，再双酶切。

14楼2012-11-30 11:03:07

混水小虫

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13楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-30 10:16:57
楼主，我帮你查了一下，一般载体的多克隆位点区域中，SalI与HindIII的识别位点差距都在15个bp以上，同时翻阅酶的说明书，查得一般10bp以上的双酶切不存在同时双切效率损失的问题，一般甚至4bp以上的距离都能保持50% ...

谢谢你的解答。那按照你所说，在酶切中同时加上去磷酸化酶，进行酶切。这是对双酶切吗？双酶切没有必要加吧？

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15楼2012-11-30 11:58:16

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14楼: Originally posted by wangqi20092 at 2012-11-30 11:03:07
看看takara的这两个酶，能不能双酶切，如果能的话，过夜酶切。我以前就隔5bp都用了，没问题。另外你可以用两个酶分别单酶切，确定酶能用，保证能用之后，再双酶切。

过夜酶切？酶切时间太长，也不是太好吧？能不能分享一下，你之前做的双酶切的体系啊？？

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16楼2012-11-30 11:59:38

czdaeq

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15楼: Originally posted by 混水小虫 at 2012-11-30 11:58:16
谢谢你的解答。那按照你所说，在酶切中同时加上去磷酸化酶，进行酶切。这是对双酶切吗？双酶切没有必要加吧？...

我的意思是，不管你的SalI 和 HindIII是否相互影响，去磷酸化酶都是必须加的——即这里应该是三酶切！
顺便提一下去磷酸只是针对质粒，PCR片段就不需要了。

17楼2012-11-30 15:06:44

czdaeq

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哦，我明白你的意思了，你以为双酶切切掉了一部分，就不用去磷酸化了？
但是实际上你的后续纯化步骤中并没有把切掉的部分去除掉，在酶连的时候，还是会发生自连的。

18楼2012-11-30 15:08:54

混水小虫

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18楼: Originally posted by czdaeq at 2012-11-30 15:08:54
哦，我明白你的意思了，你以为双酶切切掉了一部分，就不用去磷酸化了？
但是实际上你的后续纯化步骤中并没有把切掉的部分去除掉，在酶连的时候，还是会发生自连的。...

这个，还真的是第一次听说呢！！好吧，我太孤陋寡闻了！！但是在进行后续步骤中，还有有纯化这个步骤呢！！

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19楼2012-11-30 15:53:01

cicelyzh

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8楼: Originally posted by 混水小虫 at 2012-11-30 09:09:58
忘了说了，我用的酶时宝生物的酶。如果按照你说的那个简单的办法，在第一次酶切后，直接补加缓冲液，以满足第二次酶切的需要，再加第二次酶切所用的酶，那么问题来了，因为此时载体只进行了单酶切，在第二次酶切开 ...

自连也需要加连接酶的，你的体系里没有连接酶，载体不会自己连接的。

20楼2012-12-01 08:00:55