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混水小虫

金虫 (小有名气)

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[求助] 分步双酶切

对质粒进行Hind III 和Sal I双酶切，因两个酶切位点离的太近（中间10个bp），请问是否应该采用分步酶切啊？
还有就是如果采用双酶切，这两个酶的酶切顺序如何确定啊？
在第一次酶切后，是不是必须要进行去磷酸化处理？看到之前的帖子上，说关于分步酶切中间的纯化步骤中，很多同学都没有说去磷酸化处理这个环节，是不是这一环节可以省略啊？
纯化方法哪个较好些啊？有些同学说是要电泳再割胶回收，有的说不电泳直接乙醇沉淀法回收，也有的人说不电泳直接加入溶胶buffer，开始回收！
请熟知这一方面的大虾给点帮助吧！

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期待，美好的生活！！

1楼 2012-11-29 21:16:54

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混水小虫

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引用回帖:

5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-30 06:52:59
分步双酶切没有问题。10bp的话酶切效率应该是没问题的，那个先切都可以。两个酶之间不用磷酸酶处理。你可以做切胶回收，但没什么必要。如果保证切好了可以直接乙醇沉淀。还有更简单的办法，先用HindIII/NEB buffer2 ...

忘了说了，我用的酶时宝生物的酶。如果按照你说的那个简单的办法，在第一次酶切后，直接补加缓冲液，以满足第二次酶切的需要，再加第二次酶切所用的酶，那么问题来了，因为此时载体只进行了单酶切，在第二次酶切开始之前，载体会不会自连啊？