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混水小虫

金虫 (小有名气)

[求助] 分步双酶切

对质粒进行Hind III 和Sal I双酶切,因两个酶切位点离的太近(中间10个bp),请问是否应该采用分步酶切啊?
还有就是如果采用双酶切,这两个酶的酶切顺序如何确定啊?
在第一次酶切后,是不是必须要进行去磷酸化处理?看到之前的帖子上,说关于分步酶切中间的纯化步骤中,很多同学都没有说去磷酸化处理这个环节,是不是这一环节可以省略啊?
纯化方法哪个较好些啊?有些同学说是要电泳再割胶回收,有的说不电泳直接乙醇沉淀法回收,也有的人说不电泳直接加入溶胶buffer,开始回收!
请熟知这一方面的大虾给点帮助吧!
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期待,美好的生活!!
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混水小虫

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2012-11-29 22:41:57
10bp不短,注意SalI这个酶不怎么好用,多切一会吧

我双酶切 切了好几次了。一般都是酶切6个小时。可最后连接转化后,总是出现假阳性的现象!很是郁闷啊!!
期待,美好的生活!!
7楼2012-11-30 09:06:36
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉回收两次样品损失太多,先试试双酶切呗,多切一会试试,我的相隔33bp切开了。再说就不能换换酶切位点吗?
2楼2012-11-29 21:58:32
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ben1147

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
10个bp不短了,不用分步,直接一次双酶切

双酶切载体不会自连,不用去磷酸化
3楼2012-11-29 22:35:54
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

10bp不短,注意SalI这个酶不怎么好用,多切一会吧
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2012-11-29 22:41:57
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