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基因克隆与亚克隆 分离或合成外源基因 从基因组文库中筛选 基因组DNA是指某种生物或细胞器或某个染色体基因组DNA即包括其所有的基因序列。基因组文库，就是将上述基因组DNA用适当地限制性内切酶切成片段，与载体连接，重组DNA导入适当宿主细胞中增殖，获得各DNA片断地克隆，克隆数目应当包括某种生物、细胞器或某个染色体基因组所有的DNA片段即全部遗传信息，这一组克隆总称为基因组或基因文库（genomic library）。基因组克隆片段不但包括编码序列（外显子），也含非编码序列如内含子及各种顺式调节元件等。 从cDNA文库中筛选 如果从某种生物细胞抽提总RNA，再通过反转录酶反应生成总cDNA，用构建gDNA文库相同的方法，可以构建某种生物组织细胞的cDNA文库，如人肝cDNA文库、人脑cDNA文库等。由cDNA文库也可以筛选出所需的目的基因。cDNA文库与gDNA文库不同，它只有表达的转录体（包括RNA、蛋白质或多肽的转录体）互补序列，不包括内含子和其他不表达的DNA序列。 PCR扩增目的基因 建立gDNA文库和cDNA文库，从文库中分离目的基因虽然有效，但步骤多、费时、筛选工作量大等困难，而且更重要的问题是往往不能获得完整的全长基因。PCR技术可根据研究目的不同，既可以选择以DNA为模板，通过扩增后得到含有包括内含子和调控顺序在内的完整基因；又可选择以RNA为起始材料，经反转录成cDNA，扩增后得到无内含子、无调控顺序，只有结构基因转录体的互补片断。通过PCR扩增可获得目的DNA或其中某一特定顺序，用于亚克隆、酶切分析、建立cDNA文库或作为探针。PCR技术的诞生，使基因克隆中操作变得更为快捷和准确。 目的基因与载体重组 特定靶基因插入载体DNA，经DNA连接酶催化形成嵌合DNA。连接不同的DNA分子有很多方案可供选择，需要根据具体情况综合判断而定。在设计基因亚克隆的方案是，最好采用电脑相应软件程序进行设计，最佳连接方案是载体与靶DNA均具有两个不同的互补粘性末端。如果载体与插入片断末端缺乏互补的粘性末端，可以考虑用下列方法来解决：1，利用两种或更多载体的多克隆位点，经多次亚克隆，改变外源DNA片断两侧的酶切位点，使其与载体的两个不同粘性末端互补；2，利用人工接头（linker或adaptor），在外源性DNA片断或线性载体两端形成粘性末端。 粘性末端连接法 全同源互补粘性末端 靶基因片断和载体DNA，经适当的相同限制性内切酶分别消化，使他们两端各具有相同的粘性末端。在适宜温度条件下，二者互补末端碱基配对，经DNA连接酶作用，共价连接成新的重组DNA分子。这称为全同源粘性末端连接。该法最简单而且连接效率高，在克隆繁殖后，用同一限制酶消化，可回收插入DNA片断。 做双酶切时要注意以下几点： 任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。 双酶切时如果两种酶反应温度一致而buffer不同时，可查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同buffer中的活力表(也可以向ebiotrade.com客户服务部索取)，如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。如果两种酶厂家不同无法查时可比较其buffer成份，相似的话可以考虑各取一半中和。 如果2种酶的buffer成份相差较大或2种酶的反应温度不同则必须分别做酶切。第1种酶切后要考虑用酚抽、电泳或加热等方法使酶失活后再进行下一次酶切反应。厂家目录一般都会有相应的附录以供查阅各种酶的反应温度。有的酶可以用加热使之失活，有的则不行，这些信息也可以在有关附录中查询，也可以向ebiotrade.com客户服务部索取。 第一次酶切后通过电泳确证酶切完全后可以从胶中回收DNA片段再进行下次酶切，也可以在第一个酶切后直接用PCR产物回收试剂盒或Nucleotide Removal Kit纯化酶切样（只需5分钟），保留少量样品做电泳分析之用，再进行下一次酶切。还可以用一种离心纯化管或叫做离心浓缩管（Eppendorf，S&S等厂家有售），将酶切样加入后离心，盐等成份被过滤掉而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ddH2O，离心以洗去膜上残留的杂质，再加几微升ddH2O在膜上，将柱子反转插入新的eppendorf管上，离心，即可将DNA片段离下来，做下一次酶切。 特别注意：在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。比如质粒pLITMUS29的多克隆位点中BamH I旁边有Hind III位点，如果先切BamH I再切Hind III 时就会出现Hind III切不动的情况，但是反过来就没问题。更详细的数据可参考相应的附录，也可以向ebiotrade.com客户服务部索取。 双酶切体系由于插入DNA片段与载体共4个末端全为粘性互补，所以外源基因插入可能有正反两个方向；靶DNA/靶DNA，载体/载体，靶DNA/载体均可连接。在反应体系中，调整插入DNA片段与载体之间的浓度，将外源DNA片段浓度提高，使其与载体分子比以3：1为宜；另是用碱性磷酸酶将载体分子上5’-P切除。上述措施均可减少载体分子自身环化和串连。该方法的突出缺点是克隆的筛选费时。在构建表达重组体时，插入DNA片段必需与上游启动子的方向保持一致（均为5’-3’），否则导致阅读框错向，外源基因无法正确转录和翻译表达或完全不表达。因此，构建表达重组体需进行内切酶切分析，鉴定插入DNA片段的方向。鉴定方法是：在插入位点相邻的载体和插入DNA片段各选一个相同或不同的酶切位点，用内切酶消化重组载体根据凝胶电泳的消化DNA片段长度，即可判断是正向或反向插入。构建表达载体一般都需要选择定向克隆。 我们应用的双酶切体系： 1) 在Tube管中加入下列反应液，全量为30μl DNA 1~2μg 10×Buffer 3μl 内切酶1 0.75μl 内切酶2 0.75μl 灭菌超纯水 up to30μl 2) 37°C酶切4~5小时 3) DNA凝胶电泳，酶切回收。 非同源互补粘性末端 使外源DNA片段定向插入载体分子中的克隆方案叫定向克隆。定向克隆是将靶DNA片段和载体分别用两个不同的限制性内切酶切割，使两种DNA片段自身的5’和3’粘性末端不同，但二者相同末端又互补，这明显减少插入DNA片段和载体自身环化与串连，减低假阳性重组体的形成，使外源DNA片段能正向插入载体启动子下游，这是成功表达外源基因的基本条件。定向克隆要求：线性载体DNA分子的两个末端不能互补，或为两种不同的粘性末端，或为粘性末端/一侧为平端。前一种“粘-粘”形式经两种不同的内切酶分别消化载体而产生，但这两种酶不能是同裂解酶或能产生互补粘性末端的内切酶。“粘-粘”定向克隆效率非常高，是重组方案中最有效，最简捷的途径。“粘-平”形式的末端有两种途径产生：用一个产生平端的内切酶与一个产生粘性末端的内切酶联合消化DNA即产生；或用两个产生不同粘性末端的内切酶消化，使载体与靶DNA的一个末端互补，连接后再将另一个不互补的粘性末端用Smal或绿豆 |
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2楼2011-03-23 15:09:45
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