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双酶切很近的酶切位点，总是切不成功，如何解决？已有6人参与
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实验需要将已有的载体进行双酶切，再插入一段片段。 由于只能插入到多克隆位点上，所以酶切位点的选择有限，只能选择靠得很近的两个酶切位点，序列是： GACGTCGGATCCGAATTCGGTACC 需要切的是GACGTC（Aat II）和GGTACC（Kpn I） 之前用的TAKARA的酶，由于Buffer不同，分步酶切，但是效率一直很低，得不到最终的双酶切。 后来用NEB的酶，使用的是Aat II 和 Kpn I HF快切酶。 然后回收（回收浓度也非常低，0.004~0.015（ug/ul）之间），与目的片段连接。 由于插入片段的目的是为了破坏氨苄的抗性，同时载体本身具有卡纳的抗性。 所以转化之后，先用卡纳平板筛选， 挑斑到卡纳液体LB中，摇浑后再取部分在amp液体LB中培养，想着amp不浑浊的就是插入了片段的。 可是挑了几十个斑，都是两种抗性都有，随机挑了两个进行测序，发现目的片段压根就没有插入。 中间换了新酶切后的插入片段进行连接，仍然没有成功。 又做了一次双酶切，回收条带也非常浅。 是要再多次做一下双酶切嘛？（因为第一次有六个载体同时做双酶切，但是又试了两个进行连接，也都没有连接上） 不知道有什么方法可以更好地进行双酶切？ 求大神醍醐灌顶。。。 |
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