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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
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明太鱼

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接载体相关已有4人参与

最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。

连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。

用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。
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1楼2015-03-29 19:41:44
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xydjlove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:14
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？
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活在当下
2楼2015-03-29 21:51:22
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SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:17
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切体系的体积，或者换一管酶。
你的T4连接可以常温连接过夜，如果仍然不行，也建议你换一罐T4
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3楼2015-03-29 23:04:21
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

刚开始做载体连接，当时还不知道会这样，现在不想改了，已经到连表达载体这步了，只想看看有没有什么方法，可以不换酶切位点的
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4楼2015-03-30 09:12:27
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 23:04:21
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。 ...

说实话应该就是载体没切完全，我试着加大了体系，这两种酶分别切和直接双切，跑电泳都是单条带，但不在一个位置，我就费解了，而且SpeI相对的较贵啊，我用了很多啊，良心不安啊，我今早又换了DH5α，死马当活马医了，看能不能有点效果，真心不想换酶切位点啊
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5楼2015-03-30 09:17:23
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 23:04:21
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。 ...

应该不是药的问题，大家都用啊，谁也没像我这么纠结啊
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6楼2015-03-30 09:18:34
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

我是连T载体后测序找相应的酶切位点，结果发现T上符合条件且常用的酶切位点基因上有，所以只能在基因的非开放读码框处选了一个SpeI，这个纠结的酶切位点，刚开始做相关的我还不会设计引物时引酶切位点啊，
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7楼2015-03-30 09:24:46
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lilyshuoxu
8楼2015-03-30 09:45:14
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主载体切不开呀，那你可以换载体试试。
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采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-03-30 10:28:05
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SAM001

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 明太鱼 at 2015-03-30 09:17:23
说实话应该就是载体没切完全，我试着加大了体系，这两种酶分别切和直接双切，跑电泳都是单条带，但不在一个位置，我就费解了，而且SpeI相对的较贵啊，我用了很多啊，良心不安啊，我今早又换了DH5α，死马当活马医了 ...

你用的是什么公司的酶，不同酶的组合用的buffer可能不一样。单条带可能一个是没切开的超螺旋，一个是切开一半的质粒
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10楼2015-03-30 10:57:46
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