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连接载体相关 已有4人参与
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最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。 连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。 用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。 |
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