应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
261/3返回列表123下一页
查看: 1901  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

明太鱼

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接载体相关 已有4人参与

最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。

连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。

用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-03-29 19:41:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xydjlove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:14
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？
赞一下 回复此楼
活在当下
2楼2015-03-29 21:51:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:17
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切体系的体积，或者换一管酶。
你的T4连接可以常温连接过夜，如果仍然不行，也建议你换一罐T4
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-29 23:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

刚开始做载体连接，当时还不知道会这样，现在不想改了，已经到连表达载体这步了，只想看看有没有什么方法，可以不换酶切位点的
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-30 09:12:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 23:04:21
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。 ...

说实话应该就是载体没切完全，我试着加大了体系，这两种酶分别切和直接双切，跑电泳都是单条带，但不在一个位置，我就费解了，而且SpeI相对的较贵啊，我用了很多啊，良心不安啊，我今早又换了DH5α，死马当活马医了，看能不能有点效果，真心不想换酶切位点啊
赞一下 回复此楼
5楼2015-03-30 09:17:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-29 23:04:21
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。 ...

应该不是药的问题，大家都用啊，谁也没像我这么纠结啊
赞一下 回复此楼
6楼2015-03-30 09:18:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

我是连T载体后测序找相应的酶切位点，结果发现T上符合条件且常用的酶切位点基因上有，所以只能在基因的非开放读码框处选了一个SpeI，这个纠结的酶切位点，刚开始做相关的我还不会设计引物时引酶切位点啊，
赞一下 回复此楼
7楼2015-03-30 09:24:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lilyshuoxu
8楼2015-03-30 09:45:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主载体切不开呀，那你可以换载体试试。
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-03-30 10:28:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SAM001

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 明太鱼 at 2015-03-30 09:17:23
说实话应该就是载体没切完全，我试着加大了体系，这两种酶分别切和直接双切，跑电泳都是单条带，但不在一个位置，我就费解了，而且SpeI相对的较贵啊，我用了很多啊，良心不安啊，我今早又换了DH5α，死马当活马医了 ...

你用的是什么公司的酶，不同酶的组合用的buffer可能不一样。单条带可能一个是没切开的超螺旋，一个是切开一半的质粒
赞一下 回复此楼
10楼2015-03-30 10:57:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 明太鱼 的主题更新
261/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +5 启萌科技 2026-08-12 14/700 2026-08-14 15:22 by 启萌科技
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +4 Ldrop2023 2026-08-13 4/200 2026-08-14 14:50 by Tide man
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +23 Lanmanbaby 2026-08-09 37/1850 2026-08-14 13:40 by Equinoxhua
[基金申请] filecode +5 cratir 2026-08-14 9/450 2026-08-14 12:25 by 医学老男孩
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +5 工厂打螺丝 2026-08-08 5/250 2026-08-14 11:03 by 玖戈弋
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +10 Tide man 2026-08-10 11/550 2026-08-14 10:30 by 沁言学术
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 12/600 2026-08-13 23:20 by iwuli
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭