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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-30 10:57:46
你用的是什么公司的酶，不同酶的组合用的buffer可能不一样。单条带可能一个是没切开的超螺旋，一个是切开一半的质粒...

用的是Takara的酶，BamHI和SpeI有可以公用的buffer,Kbuffer,但是他做的双酶切效果图中并没有这两种酶的酶切效果显示
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11楼2015-03-30 11:01:08
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by SAM001 at 2015-03-30 10:57:46
你用的是什么公司的酶，不同酶的组合用的buffer可能不一样。单条带可能一个是没切开的超螺旋，一个是切开一半的质粒...

我酶切后的单条带，与原质粒并不在一个位置
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12楼2015-03-30 11:02:17
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 10:28:05
楼主载体切不开呀，那你可以换载体试试。

换载体的话没有合适的酶切位点，得重新设计引物，又得平滑什么的
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13楼2015-03-30 11:03:34
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781055707

木虫 (著名写手)
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13楼: Originally posted by 明太鱼 at 2015-03-30 11:03:34
换载体的话没有合适的酶切位点，得重新设计引物，又得平滑什么的...

先在要连得载体上看看目的片段SpeI后面的酶切片段，再在t载体上查查有无这个酶切位点，在T载体上这个酶切位点可以是两个或以上。
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采菊东篱下，悠然见南山。
14楼2015-03-30 11:22:24
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 11:22:24
先在要连得载体上看看目的片段SpeI后面的酶切片段，再在t载体上查查有无这个酶切位点，在T载体上这个酶切位点可以是两个或以上。...

表达载体上SpeI后还有SacI,和EcoRI是但酶切位点，也就是可以选SpeISacI或SpeIEcoRI、但是在连接好基因的T载体上，这两种组合切下的片段都是相反的，即在T上SacIEcoRI都在SpeI前面，
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15楼2015-03-30 12:23:22
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781055707

木虫 (著名写手)
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15楼: Originally posted by 明太鱼 at 2015-03-30 12:23:22
表达载体上SpeI后还有SacI,和EcoRI是但酶切位点，也就是可以选SpeISacI或SpeIEcoRI、但是在连接好基因的T载体上，这两种组合切下的片段都是相反的，即在T上SacIEcoRI都在SpeI前面，...

在合成一对加酶切位点，保护碱基的引物吧，在扩出来连过，引物反正一二百就行了。
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采菊东篱下，悠然见南山。
16楼2015-03-30 12:45:15
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 12:45:15
在合成一对加酶切位点，保护碱基的引物吧，在扩出来连过，引物反正一二百就行了。...

这个想过了，表达载体上其他可用的酶切位点不是反向的就是基因内部有，很纠结的一个基因，还可以用XbaI和SpeI做 双酶切，他们两个是表达载体上相邻的酶切位点，好像是同尾酶，不知道可不可以这么做请指教（表达载体上单酶切位点顺序BamHIXbaISpeI由于用BamHI和SpeI载体总是切不净，那么用相邻的XbaI和SpeI会怎么样呢）
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17楼2015-03-30 15:58:24
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 明太鱼 at 2015-03-30 15:58:24
这个想过了，表达载体上其他可用的酶切位点不是反向的就是基因内部有，很纠结的一个基因，还可以用XbaI和SpeI做 双酶切，他们两个是表达载体上相邻的酶切位点，好像是同尾酶，不知道可不可以这么做请指教（表达载体 ...

什么载体？
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采菊东篱下，悠然见南山。
18楼2015-03-30 16:40:09
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稻稻

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的BamHI和SpeI中间有多少bp?我之前构建的载体两个酶切位点中间24bp都挺顺利的。你能确定是因为表达载体大片段酶切的问题导致无法酶连吗？有没有考虑其他原因，比如可能是小片段浓度低

[ 发自小木虫客户端 ]
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做一个不动声色的人，不准情绪化，不准回头看。
19楼2015-03-30 17:04:35
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
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18楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 16:40:09
什么载体？...

是实验室改造的载体，上面的单酶切位点只有BamHIXbaISpeIPstISacIEcoRI,具体他们之间间隔多少我得再问问
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20楼2015-03-30 18:03:53
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