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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
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明太鱼

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接载体相关 已有4人参与

最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。

连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。

用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。
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1楼 2015-03-29 19:41:44
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 12:45:15
在合成一对加酶切位点，保护碱基的引物吧，在扩出来连过，引物反正一二百就行了。...

这个想过了，表达载体上其他可用的酶切位点不是反向的就是基因内部有，很纠结的一个基因，还可以用XbaI和SpeI做 双酶切，他们两个是表达载体上相邻的酶切位点，好像是同尾酶，不知道可不可以这么做请指教（表达载体上单酶切位点顺序BamHIXbaISpeI由于用BamHI和SpeI载体总是切不净，那么用相邻的XbaI和SpeI会怎么样呢）
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17楼2015-03-30 15:58:24
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xydjlove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:14
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？
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活在当下
2楼2015-03-29 21:51:22
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SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:17
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切体系的体积，或者换一管酶。
你的T4连接可以常温连接过夜，如果仍然不行，也建议你换一罐T4
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3楼2015-03-29 23:04:21
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明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

刚开始做载体连接，当时还不知道会这样，现在不想改了，已经到连表达载体这步了，只想看看有没有什么方法，可以不换酶切位点的
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4楼2015-03-30 09:12:27
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