应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
52/1返回列表
查看: 1922  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接载体相关 已有4人参与

最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。

连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。

用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-03-29 19:41:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 11:22:24
先在要连得载体上看看目的片段SpeI后面的酶切片段，再在t载体上查查有无这个酶切位点，在T载体上这个酶切位点可以是两个或以上。...

表达载体上SpeI后还有SacI,和EcoRI是但酶切位点，也就是可以选SpeISacI或SpeIEcoRI、但是在连接好基因的T载体上，这两种组合切下的片段都是相反的，即在T上SacIEcoRI都在SpeI前面，
赞一下 回复此楼
15楼2015-03-30 12:23:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 26 个回答

xydjlove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:14
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？
赞一下 回复此楼
活在当下
2楼2015-03-29 21:51:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:17
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切体系的体积，或者换一管酶。
你的T4连接可以常温连接过夜，如果仍然不行，也建议你换一罐T4
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-29 23:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

刚开始做载体连接，当时还不知道会这样，现在不想改了，已经到连表达载体这步了，只想看看有没有什么方法，可以不换酶切位点的
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-30 09:12:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 26 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +3 德尚中行 2026-08-27 3/150 2026-08-28 15:24 by rongshuxia
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭