应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接载体相关
51/1返回列表
查看: 1903  |  回复: 25
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)

[求助] 连接载体相关 已有4人参与

最近一直在做连接，持续两个月了，每次都只长假菌落，基因三百多bp，连到了18T上，选择了BanHI和SpeI切（因为没有合适的酶切位点，在基因的非开放读码框处选择了SpeI）并回收，浓度不高大约10纳克左右。

连表达载体，问题就出现了，表达载体上这两个酶切位点距离较近中间只有一个XbaI，不知道是不是这个原因，不论是分别切还是直接双切的都连不上，而且分别切和直接双切后的载体不在一条线上，找了很多办法，为了防止假阳性甚至又将酶切后的载体去磷酸化，假阳性是少了可是没出真的。

用的都是1:3的比例，感受态用的是实验室做的Top10,虽说自己做的可能没有买的好，但是其他同学用也都连上了，我就不知道该怎么办了，请各位大神指点一二。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-03-29 19:41:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

我是连T载体后测序找相应的酶切位点，结果发现T上符合条件且常用的酶切位点基因上有，所以只能在基因的非开放读码框处选了一个SpeI，这个纠结的酶切位点，刚开始做相关的我还不会设计引物时引酶切位点啊，
赞一下 回复此楼
7楼2015-03-30 09:24:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 26 个回答

xydjlove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:14
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？
赞一下 回复此楼
活在当下
2楼2015-03-29 21:51:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

SAM001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-30 08:30:17
首先你要做一个对照。就是只加载体，不加片段，再加buffer、酶进行反应，然后转化。看看是否你的载体没有切开，如果载体没切开的话，对照也会长出很多假阳性菌落。
如果一直是假阳性菌落很多，可能你的酶活性不高。可以加大酶切体系的体积，或者换一管酶。
你的T4连接可以常温连接过夜，如果仍然不行，也建议你换一罐T4
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-29 23:04:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

明太鱼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xydjlove at 2015-03-29 21:51:22
一般不选择很近的两个酶切位点，会影响酶切效率，刚开始设计引物时，怎么没有引入合适的酶切位点呢？

刚开始做载体连接，当时还不知道会这样，现在不想改了，已经到连表达载体这步了，只想看看有没有什么方法，可以不换酶切位点的
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-30 09:12:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 26 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +25 医学老男孩 2026-08-13 54/2700 2026-08-15 13:13 by 医学老男孩
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 7lpolszZVXgi 2026-08-14 8/400 2026-08-15 11:53 by KxMI1BYBxWX1
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-15 11:41 by KxMI1BYBxWX1
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 07:09 by 4wMiSEwB6436
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:45 by 4wMiSEwB6436
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 7lpolszZVXgi 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:41 by 4wMiSEwB6436
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 4/200 2026-08-15 01:28 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 7/350 2026-08-15 00:40 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[基金申请] filecode +15 documentary 2026-08-10 17/850 2026-08-14 10:08 by kissu88
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 32/1600 2026-08-14 09:37 by 要乐观耀哥
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭