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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切很近的酶切位点，总是切不成功，如何解决？
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dadhz

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

“先用卡纳平板筛选， 挑斑到卡纳液体LB中，摇浑后再取部分在amp液体LB中培养，想着amp不浑浊的就是插入了片段的……”

为啥破坏掉amp抗性？

另外我的建议
1。连接时目的基因数量比质粒起码多五倍以上

2。酶切时间增长到一小时以上，切透。

你的两个位点离得不算特别近，即使两个酶切位点紧挨着也应该都能切开，我做过两个酶切位点间隔了六个碱基的，完全没问题，所以你的问题可能不是出在酶切位点距离上

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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11楼2015-12-20 16:33:08
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chongju135

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

是否做好阴性对照，另外是否用磷酸酶处理防止自连？
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12楼2015-12-21 09:25:12
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by dadhz at 2015-12-20 16:33:08
“先用卡纳平板筛选， 挑斑到卡纳液体LB中，摇浑后再取部分在amp液体LB中培养，想着amp不浑浊的就是插入了片段的……”

为啥破坏掉amp抗性？

另外我的建议
1。连接时目的基因数量比质粒起码多五倍以上

2。 ...

嗯，是的，破坏amp抗性是为了后续的实验。确实酶切位点不是很近，之前师兄切过更近的位点，不过他已经毕业一年多了，不做生物了。
不过内切酶没有了，所以准备听另一个师兄的话，直接合成想要的片段。
谢谢哈
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13楼2015-12-21 15:49:41
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by chongju135 at 2015-12-21 09:25:12
是否做好阴性对照，另外是否用磷酸酶处理防止自连？

嗯，做过一次对照，单酶切，l连接的时候也做了只有载体的连接对照。不过酶用完了，现在准备直接进行合成。谢谢哈
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14楼2015-12-21 15:51:00
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吗子

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

两个酶切位点没有问题，建议可以酶切4-5 h，多切几管一起回收，切的时候分别做个单酶切的对照。连接的时候也要根据回收片段的浓度和大小选择合适的连接比例。酶切做不好的话后面连接更难成功。我觉得连接成功都是些小概率事件所以祝好运啊
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深秋
15楼2015-12-21 16:08:00
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宁静的夏

新虫 (小有名气)
分步酶切试试

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16楼2015-12-21 16:20:29
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 吗子 at 2015-12-21 16:08:00
两个酶切位点没有问题，建议可以酶切4-5 h，多切几管一起回收，切的时候分别做个单酶切的对照。连接的时候也要根据回收片段的浓度和大小选择合适的连接比例。酶切做不好的话后面连接更难成功。我觉得连接成功都是些 ...

嗯嗯，我也是这样想，每次连接之后都挑二十几个菌，可能还是挑的少，哈哈。
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17楼2015-12-21 18:04:59
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gookies

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 宁静的夏 at 2015-12-21 16:20:29
分步酶切试试

嗯，一开始就是分布酶切，但回收回来的总是不好，就买的NEB的快切酶，不过最近准备合成了，碱基数也不多。
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18楼2015-12-21 18:06:05
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宁静的夏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by gookies at 2015-12-21 18:06:05
嗯，一开始就是分布酶切，但回收回来的总是不好，就买的NEB的快切酶，不过最近准备合成了，碱基数也不多。...

好主意

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19楼2015-12-21 19:00:05
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

You can use other restriction site to cut the vector; and use some special enzyme to cut your insert to get the same cohesive end. These enzyme include BsaI, BbsI, BsmBI etc. Good luck!
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ANNA&KEVIN
20楼2016-01-09 11:50:42
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