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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » QPCR溶解曲线问题
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急躁的小脾气

新虫 (初入文坛)

[求助] QPCR溶解曲线问题

求助大神。。。
开始我用普通PCR跑了这对引物，也跑了胶，结果还蛮好的，没有引物二聚体和非特异性，产物长度也是对的，283bp。
但是用QPCR做了之后，大多数溶解曲线出现双峰，还有的峰的位置都变了。
求大神赐教，我这种情况是样本被污染了吗？

QPCR溶解曲线问题
AC07F37566F8953944E91A807B6F2A8D.jpg@biostar2009
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1楼 2017-04-10 15:29:23
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

idealgas

新虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-12 22:13:11
确切说qPCR条件跟普通pcr条件不一样，检测精度也不一样，经验告诉我用普通pcr检测q的不能说明什么问题。另外电泳的检测灵敏度也可能看不到非特异性扩增产生的条带，而

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2楼2017-04-10 16:46:38
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深海看星

新虫 (初入文坛)
有的时候普通p跑出来的qpcr也不一定能跑出来。普通p只是大概看下引物特异性。

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3楼2017-04-10 16:53:36
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idealgas

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 急躁的小脾气 at 2017-04-10 21:51:40
那我的结果里有些溶解曲线是可取的，这几条能用吗？
...

溶解曲线单一峰就可用。如果你不考虑扩增效率的话。

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5楼2017-04-10 22:21:59
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niil

金虫 (正式写手)
你这个杂峰的位置可能是引物二聚体，你的实时定量pcr程序如何？你用的引物的退火温度是多少？

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Stop fighting,let it flow.
6楼2017-04-11 06:41:09
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急躁的小脾气

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 深海看星 at 2017-04-10 16:53:36
有的时候普通p跑出来的qpcr也不一定能跑出来。普通p只是大概看下引物特异性。

嗯   的确是这样    但是我这个情况貌似和样本也有关系，毕竟有些样本的溶解曲线是正常的，但大部分样本p出来的出现的可能是引物二聚体。
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9楼2017-04-11 08:47:11
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普通回帖

急躁的小脾气

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by idealgas at 2017-04-10 16:46:38
确切说qPCR条件跟普通pcr条件不一样，检测精度也不一样，经验告诉我用普通pcr检测q的不能说明什么问题。另外电泳的检测灵敏度也可能看不到非特异性扩增产生的条带，而
...

那我的结果里有些溶解曲线是可取的，这几条能用吗？

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4楼2017-04-10 21:51:40
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急躁的小脾气

新虫 (初入文坛)
哦  好的   谢谢
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7楼2017-04-11 08:39:18
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急躁的小脾气

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by niil at 2017-04-11 06:41:09
你这个杂峰的位置可能是引物二聚体，你的实时定量pcr程序如何？你用的引物的退火温度是多少？

退火温度是54℃，程序是：95℃预变性3min，变性10s，54度10s，72℃15s，40个循环，65℃（0:05），升温到95℃
样本不同，产生引物二聚体的情况不同，总共有24个样本，只有几条是没有出现引物二聚体的。
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8楼2017-04-11 08:45:06
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fengzi3321

银虫 (初入文坛)
换引物吧

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10楼2017-04-12 22:09:29
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