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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同
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不负青春7

新虫 (小有名气)

[交流] 关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同 已有4人参与

如图，前面的峰是标准质粒的，后边的峰是我的土壤样品的，两个峰相距太远了。标准质粒的峰应该是没什么问题的，和别人的横坐标值差不多，就是不知道样品为什么会是这样。另外，标准质粒是我自己PCR后，胶回收，连接转化等步骤后做的。请问前辈们大神们，这是为什么啊？这样做出来的数据能用吗？

关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同
溶解曲线.gif
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1楼 2016-01-31 03:54:47
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街角是沉默

新虫 (初入文坛)
★
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楼主你好，不知道你现在还可不可以看到这个问题了，我现在在做定量出现了类似情况，就是标曲和样品的融解曲线Tm值相差了2℃，不知道结果是否可用，你搞明白了没

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18楼2017-03-11 16:37:54
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不负青春7: 金币+2 2016-02-18 12:53:50
跑个电泳，看看样品的条带跟质粒的条带是否一样大小~
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2楼2016-02-01 12:11:40
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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不负青春7: 金币+3 2016-02-18 13:07:08
样品是土壤中提得metagenome？若是，这个reasonable。你的standard可以用土壤做的。
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向钱看，向厚赚
3楼2016-02-02 05:08:20
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不负青春7

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-01 12:11:40
跑个电泳，看看样品的条带跟质粒的条带是否一样大小~

放假回家了，没有及时看帖，很抱歉。谢谢您的回复。我跑了电泳的，见下图，条带不是很清晰，前几条带是质粒的，后几条是样品的。大体上看起来是差不多大小。
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4楼2016-02-18 13:06:01
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不负青春7

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 懒蛋 at 2016-02-02 05:08:20
样品是土壤中提得metagenome？若是，这个reasonable。你的standard可以用土壤做的。

宏基因组我不太懂是什么，因为我主要学化学。我的质粒是在土壤样品中提的。但是standard和样品的Temperature相差很大，我看别人说Tm相差要在1以下，但是我的远超过1了，这个数据可以用吗？会不会不是同一种东西啊？
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5楼2016-02-18 13:11:16
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-19 22:56:22
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-18 13:06:01
放假回家了，没有及时看帖，很抱歉。谢谢您的回复。我跑了电泳的，见下图，条带不是很清晰，前几条带是质粒的，后几条是样品的。大体上看起来是差不多大小。...

额……我看不到图……就您的熔解曲线看，您的条带是单一的，不过跟标准品的有所差距，qPCR的核心就是扩增条带一定要是您的目的基因的，如果条带大小看不出差异，终极方法是将您样品的条带测序，看看是否是您需要检测的基因，如果是，就算熔解曲线大小不同也无所谓的。
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6楼2016-02-19 08:52:22
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
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5楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-18 13:11:16
宏基因组我不太懂是什么，因为我主要学化学。我的质粒是在土壤样品中提的。但是standard和样品的Temperature相差很大，我看别人说Tm相差要在1以下，但是我的远超过1了，这个数据可以用吗？会不会不是同一种东西啊？...

宏基因组就是您提取的土壤中所有微生物基因组的总和，是个混合物而不是单一的某个微生物的基因组。
另外推荐一个网址给你：https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php
这个网页中可以预测您的熔解曲线，看看是否跟您的一致~
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7楼2016-02-19 08:55:37
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不负青春7

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 08:52:22
额……我看不到图……就您的熔解曲线看，您的条带是单一的，不过跟标准品的有所差距，qPCR的核心就是扩增条带一定要是您的目的基因的，如果条带大小看不出差异，终极方法是将您样品的条带测序，看看是否是您需要检 ...

图我没能传上。今天又跑了次胶，条带大小看不出差异。我再问您下，测序的话麻烦吗？将条带上胶回收后，再怎样做呢？
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8楼2016-02-19 12:29:27
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
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8楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-19 12:29:27
图我没能传上。今天又跑了次胶，条带大小看不出差异。我再问您下，测序的话麻烦吗？将条带上胶回收后，再怎样做呢？...

很简单，直接送给生物公司测就可以了，给他们点引物用来测序。
一两天就可以测好，到时候比对一下序列看看是不是你的目的基因。
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9楼2016-02-19 12:48:50
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不负青春7

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9楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 12:48:50
很简单，直接送给生物公司测就可以了，给他们点引物用来测序。
一两天就可以测好，到时候比对一下序列看看是不是你的目的基因。...

拿去测序的样品是什么样的样品？是RT-PCR的产物，还是胶回收后产物？
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10楼2016-02-19 13:04:12
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