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不负青春7

新虫 (小有名气)

[交流] 关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同已有4人参与

如图,前面的峰是标准质粒的,后边的峰是我的土壤样品的,两个峰相距太远了。标准质粒的峰应该是没什么问题的,和别人的横坐标值差不多,就是不知道样品为什么会是这样。另外,标准质粒是我自己PCR后,胶回收,连接转化等步骤后做的。请问前辈们大神们,这是为什么啊?这样做出来的数据能用吗?

关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同
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街角是沉默

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主你好,不知道你现在还可不可以看到这个问题了,我现在在做定量出现了类似情况,就是标曲和样品的融解曲线Tm值相差了2℃,不知道结果是否可用,你搞明白了没

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18楼2017-03-11 16:37:54
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不负青春7: 金币+2 2016-02-18 12:53:50
跑个电泳,看看样品的条带跟质粒的条带是否一样大小~
2楼2016-02-01 12:11:40
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
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不负青春7: 金币+3 2016-02-18 13:07:08
样品是土壤中提得metagenome?若是,这个reasonable。你的standard可以用土壤做的。
向钱看,向厚赚
3楼2016-02-02 05:08:20
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不负青春7

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-01 12:11:40
跑个电泳,看看样品的条带跟质粒的条带是否一样大小~

放假回家了,没有及时看帖,很抱歉。谢谢您的回复。我跑了电泳的,见下图,条带不是很清晰,前几条带是质粒的,后几条是样品的。大体上看起来是差不多大小。
4楼2016-02-18 13:06:01
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不负青春7

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 懒蛋 at 2016-02-02 05:08:20
样品是土壤中提得metagenome?若是,这个reasonable。你的standard可以用土壤做的。

宏基因组我不太懂是什么,因为我主要学化学。我的质粒是在土壤样品中提的。但是standard和样品的Temperature相差很大,我看别人说Tm相差要在1以下,但是我的远超过1了,这个数据可以用吗?会不会不是同一种东西啊?
5楼2016-02-18 13:11:16
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-19 22:56:22
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-18 13:06:01
放假回家了,没有及时看帖,很抱歉。谢谢您的回复。我跑了电泳的,见下图,条带不是很清晰,前几条带是质粒的,后几条是样品的。大体上看起来是差不多大小。...

额……我看不到图……就您的熔解曲线看,您的条带是单一的,不过跟标准品的有所差距,qPCR的核心就是扩增条带一定要是您的目的基因的,如果条带大小看不出差异,终极方法是将您样品的条带测序,看看是否是您需要检测的基因,如果是,就算熔解曲线大小不同也无所谓的。
6楼2016-02-19 08:52:22
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lifechuteng

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-18 13:11:16
宏基因组我不太懂是什么,因为我主要学化学。我的质粒是在土壤样品中提的。但是standard和样品的Temperature相差很大,我看别人说Tm相差要在1以下,但是我的远超过1了,这个数据可以用吗?会不会不是同一种东西啊?...

宏基因组就是您提取的土壤中所有微生物基因组的总和,是个混合物而不是单一的某个微生物的基因组。
另外推荐一个网址给你:https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php
这个网页中可以预测您的熔解曲线,看看是否跟您的一致~
7楼2016-02-19 08:55:37
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不负青春7

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 08:52:22
额……我看不到图……就您的熔解曲线看,您的条带是单一的,不过跟标准品的有所差距,qPCR的核心就是扩增条带一定要是您的目的基因的,如果条带大小看不出差异,终极方法是将您样品的条带测序,看看是否是您需要检 ...

图我没能传上。今天又跑了次胶,条带大小看不出差异。我再问您下,测序的话麻烦吗?将条带上胶回收后,再怎样做呢?
8楼2016-02-19 12:29:27
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lifechuteng

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-19 12:29:27
图我没能传上。今天又跑了次胶,条带大小看不出差异。我再问您下,测序的话麻烦吗?将条带上胶回收后,再怎样做呢?...

很简单,直接送给生物公司测就可以了,给他们点引物用来测序。
一两天就可以测好,到时候比对一下序列看看是不是你的目的基因。
9楼2016-02-19 12:48:50
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不负青春7

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 12:48:50
很简单,直接送给生物公司测就可以了,给他们点引物用来测序。
一两天就可以测好,到时候比对一下序列看看是不是你的目的基因。...

拿去测序的样品是什么样的样品?是RT-PCR的产物,还是胶回收后产物?
10楼2016-02-19 13:04:12
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