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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同
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不负青春7

新虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 08:55:37
宏基因组就是您提取的土壤中所有微生物基因组的总和，是个混合物而不是单一的某个微生物的基因组。
另外推荐一个网址给你：https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php
这个网页中可以预测您的熔解曲线，看看是否跟您 ...

我试了下，还是看不懂，是要样品的溶解曲线跟预测的一致吗？您能帮我看下吗？CCCTCGGGAAAGCCTTCTTCACCAAATGCTGTAACGTCATCTCTTTGCACGATACGACCTCTCTTACCTTTAACATAGTAGAAAGCGGTGCAATAGACTTTGCCTAGGTACCACCAAACAACAAACATCAGCATCGATACGAACGCTGAGAAGAATGCTGCAATTACCGTTGTATGACCACCGAACGTACGCAGTGAGCCTTGTTCGATTAAGCGAACATATTCAGGAGTACCTGTACGTACATACATGTGTCCCATATAGTCAGCCATCGATAACAATGTGCCTTCAACTACGATTGGCAAGTGGGTCGGTCCAAAAATAACCCAGTTACCTGGATAGAAGAATAATCCAAAGAATCCGCCACCAATTAACGCTGTCACGAGCCAGTTACGGGTTAGATATAAAGTAATATCCAACATTAACGCACCTGGAATCATGATTGATGGAATTACAAAGTTAATTGGATAGTGTGACCACCAGTAGAAACCCCA
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11楼2016-02-19 13:11:23
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lifechuteng

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10楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-19 13:04:12
拿去测序的样品是什么样的样品？是RT-PCR的产物，还是胶回收后产物？...

荧光定量PCR之后，跑电泳回收条带，之后送测序
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12楼2016-02-19 13:16:16
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lifechuteng

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11楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-19 13:11:23
我试了下，还是看不懂，是要样品的溶解曲线跟预测的一致吗？您能帮我看下吗？CCCTCGGGAAAGCCTTCTTCACCAAATGCTGTAACGTCATCTCTTTGCACGATACGACCTCTCTTACCTTTAACATAGTAGAAAGCGGTGCAATAGACTTTGCCTAGGTACCACCAAACAACAAAC ...

我预测出来大概为89℃，这个跟PCR体系中的离子浓度也有关的，所以只是个预测值，跟你实际情况下的差不多……
另外，你荧光定量PCR的产物长度有点长啊，都491bp了，一般200bp左右就可以了。
反过来倒是您的标准质粒的Tm值太低，确定扩增的条带是一样的吗？
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13楼2016-02-19 13:21:01
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不负青春7

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13楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 13:21:01
我预测出来大概为89℃，这个跟PCR体系中的离子浓度也有关的，所以只是个预测值，跟你实际情况下的差不多……
另外，你荧光定量PCR的产物长度有点长啊，都491bp了，一般200bp左右就可以了。
反过来倒是您的标准质 ...

做的氨氧化细菌（AOB）,我看文献里大都用这个491bp的，所以我也用的这个。很奇怪，我给的这个序列就是在做标准品的过程中测的，也就是说标准品应该就是这个序列。我将胶回收后的样品拿去测序了，不知道能不能测出来，明天晚上会出结果。
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14楼2016-02-19 19:02:48
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不负青春7

新虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-19 13:21:01
我预测出来大概为89℃，这个跟PCR体系中的离子浓度也有关的，所以只是个预测值，跟你实际情况下的差不多……
另外，你荧光定量PCR的产物长度有点长啊，都491bp了，一般200bp左右就可以了。
反过来倒是您的标准质 ...

测序结果是这样的，什么结合、结构，不搞生物的人完全不懂在说什么。用测出来的序列，blast了一下，也不是很会看。打算放弃了，这个基因的数据先不用了。谢谢您一直以来的耐心解答。
关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同
QQ截图20160220172956.png


关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同-1
blast-标.png


关于溶解曲线-RT-qPCR熔解曲线标准质粒和样品的峰值Tm值不同-2
blast-CK.png
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15楼2016-02-20 19:36:13
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tangyafang

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15楼: Originally posted by 不负青春7 at 2016-02-20 19:36:13
测序结果是这样的，什么结合、结构，不搞生物的人完全不懂在说什么。用测出来的序列，blast了一下，也不是很会看。打算放弃了，这个基因的数据先不用了。谢谢您一直以来的耐心解答。

QQ截图20160220172956.png

b ...

你好，你是定量PCR的产物直接纯化回收后测序的吗，荧光信号会影响测序吗
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16楼2016-05-30 00:43:14
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不负青春7

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16楼: Originally posted by tangyafang at 2016-05-30 00:43:14
你好，你是定量PCR的产物直接纯化回收后测序的吗，荧光信号会影响测序吗...

好久没登录了，没看到您回复，不好意思。我当时是直接拿PCR的产物去测序的，好像也没有做纯化回收。时间有点久，有些忘记了。你问的荧光信号会不会影响测序，我也不太清楚。
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17楼2016-07-07 12:44:34
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街角是沉默

新虫 (初入文坛)
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楼主你好，不知道你现在还可不可以看到这个问题了，我现在在做定量出现了类似情况，就是标曲和样品的融解曲线Tm值相差了2℃，不知道结果是否可用，你搞明白了没

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18楼2017-03-11 16:37:54
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wxy20052002

木虫 (著名写手)
我也想知道为什么
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19楼2017-06-08 15:20:46
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