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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 还是QPCR
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] 还是QPCR

大家好！我现在刚接触QPCR，看了大量资料，还有一点不是很清楚，还请高手指点啊。。。。

优化QPCR条件的时候，要看溶解曲线是不是单峰，还要看扩增效率是否在90%-110%，最后跑电泳看是否是自己要的条带，这是完整的过程。可是问题是，我要做的基因有10几个，那么是不是每个基因都要做5个浓度梯度扩增效率曲线呢，这样一来昂贵的进口试剂用的超级快啊，有点扛不牢啊，想问说是不是溶解曲线好的并且是用的别人文献发表过的引物（但是退火温度可能不一样），扩增效率曲线是不是就不用做了呢？

不知道大家是怎么个程序呀？
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1楼 2013-01-24 22:52:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
优化条件时首先要看熔解曲线是否是单峰。多峰的话说明有非特异扩增或者引物二聚体，这样肯定不适宜做定量的。扩增效率也是需要测的。如果你用了别人发表的引物采取不同的退火温度，扩增效率在不同的温度下可能会有不同，所以不能省略扩增效率曲线。基因多也是没有办法的，每对引物都要做扩增效率曲线的。
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shiliyusly
2楼2013-01-25 08:16:45
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 08:16:45
优化条件时首先要看熔解曲线是否是单峰。多峰的话说明有非特异扩增或者引物二聚体，这样肯定不适宜做定量的。扩增效率也是需要测的。如果你用了别人发表的引物采取不同的退火温度，扩增效率在不同的温度下可能会有不 ...

嘿嘿嘿，还是你！真的非常感激你的热心解答！我昨天做了2个基因的扩增效率曲线，ACT(内标基因)，F3'H，这2个基因都有点小峰，ACT效率有140%，F3'H只有80%。唉，这2个基因都是直接拿别人文献用的，却是这个效果。
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3楼2013-01-25 09:38:00
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1, ★有帮助 2013-01-25 13:17:03
优化QPCR条件的时候，要看溶解曲线是不是单峰，还要看扩增效率是否在90%-110%，最后跑电泳看是否是自己要的条带，这是完整的过程。
是的。

可是问题是，我要做的基因有10几个，那么是不是每个基因都要做5个浓度梯度扩增效率曲线呢，这样一来昂贵的进口试剂用的超级快啊，有点扛不牢啊，
每个基因必须做梯度做一个标准曲线，包括你的基因和内参基因的，这些基因或许可用同一个内参（具体咨询你们领域的乡亲们需要）

想问说是不是溶解曲线好的并且是用的别人文献发表过的引物（但是退火温度可能不一样），扩增效率曲线是不是就不用做了呢？
还是要做，不同机器，不同公司的CHMICAL都有差异。
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4楼2013-01-25 10:15:58
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
shiliyusly: 金币+1, ★有帮助 2013-01-25 13:14:39
如果觉得耗材太贵，可以考虑把总体积减半，我做过并且一直是这样做的，结果基本没差异，只是Ct值有非常细微差异，对结果没有影响。
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5楼2013-01-25 10:29:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-25 13:18:54
引用回帖:
3楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-25 09:38:00
嘿嘿嘿，还是你！真的非常感激你的热心解答！我昨天做了2个基因的扩增效率曲线，ACT(内标基因)，F3'H，这2个基因都有点小峰，ACT效率有140%，F3'H只有80%。唉，这2个基因都是直接拿别人文献用的，却是这个效果。...

用别人发的引物也有可能出现这种结果的。一个是条件没有优化好，此外就是引物本身可能就有问题。其实如果你要做很多基因的话，不如都一起自己设计引物来得实际。毕竟别人做过的不等于你也可以重复出来。
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6楼2013-01-25 10:54:27
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chenguestc at 2013-01-25 10:29:39
如果觉得耗材太贵，可以考虑把总体积减半，我做过并且一直是这样做的，结果基本没差异，只是Ct值有非常细微差异，对结果没有影响。

嗯，我现在也用12.5ul的体系，我主要是比较杨梅度几个基因在不同成熟度时表达的差异，所以跟内标CT值计算2的△Ct方。有浙大博士告诉我只要保证内标CT值一致就行，不用做扩增效率，觉得有点困惑
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7楼2013-01-25 13:14:22
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenguestc at 2013-01-25 10:15:58
优化QPCR条件的时候，要看溶解曲线是不是单峰，还要看扩增效率是否在90%-110%，最后跑电泳看是否是自己要的条带，这是完整的过程。
是的。

可是问题是，我要做的基因有10几个，那么是不是每个基因都要做5个浓度 ...

恩恩！我做的是比较杨梅度几个基因在不同成熟度时表达的差异，所以跟内标CT值计算2的△Ct方。有浙大博士告诉我只要保证内标CT值一致就行，不用做扩增效率，是这样么，有点困惑
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8楼2013-01-25 13:16:47
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-25 10:54:27
用别人发的引物也有可能出现这种结果的。一个是条件没有优化好，此外就是引物本身可能就有问题。其实如果你要做很多基因的话，不如都一起自己设计引物来得实际。毕竟别人做过的不等于你也可以重复出来。...

我做的是比较杨梅度几个基因在不同成熟度时表达的差异，所以跟内标CT值计算2的△Ct方。有浙大博士告诉我只要保证内标CT值一致就行，不用做扩增效率，这让我有点困惑。
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9楼2013-01-25 13:18:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
shiliyusly: 金币+2, ★有帮助 2013-01-25 16:01:47
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-01-25 13:18:47
我做的是比较杨梅度几个基因在不同成熟度时表达的差异，所以跟内标CT值计算2的△Ct方。有浙大博士告诉我只要保证内标CT值一致就行，不用做扩增效率，这让我有点困惑。...

扩增效率100%是保证含量与CT之间的关系成2的幂，也是用CT来衡量模板含量的理论依据，同时也测定了模板量与CT符合这个关系的范围，所以说做定量这个是应该做的。扩增效率太高或者太低都说明2^（-CT）值已经不能很好的衡量模板量。这个从计算已经出现了偏差，也就是说样品之间相差1CT，表达量不是成2倍关系。从理论上和实际上都说不过去的吧。
至于提到的内参CT值一致，这个则说明样品的内参表达稳定，内参实际上就是要起到这个作用的。内参CT一致只能说明反转录时样品定量准确，这个内参基因选取是很适当的。这个对定量来说当然是很好的，但是这并不能取代做扩增效率。
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10楼2013-01-25 14:09:03
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