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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊
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人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊 已有3人参与

投了文章，让补定量的实验，时间比较紧。但自己是新手，做了之后结果不好，不知道问题出在哪里，还请高手指点啊！！！

做标曲时，目的基因的E=108%, 内参E=98%。 而且目的基因的，除了一个最低浓度的一个孔溶解曲线前面有个小峰外，其余都正常。见图一。
但是做我的样品时候，所有的孔，包括内参引物的在溶解曲线前面都出现了小峰，有的峰值还很高。见图二。
  
我想问：1、内参和目的基因的扩增效率差10%，是不是不能用2−ΔΔCt进行计算呢？优化体系条件能使二者的扩增效率接近吗？
              2、溶解曲线前面出现小峰，是不是因为模板有问题呢？是不是基因组DNA的污染？

真的很着急，不知道该如何解决。

请大家帮帮忙，不甚感激！！

求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊
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求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊-1
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1楼 2014-07-13 21:54:24
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 09:08:40
设计的引物不太好，前面的那个小峰应该是引物二聚体，可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。
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2楼2014-07-14 07:53:38
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-07-14 07:53:38
设计的引物不太好，前面的那个小峰应该是引物二聚体，可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。

跑胶了，没有二聚体。而且做标曲的时候没有问题，但是做样品就有小峰。内参的也有，内参的引物同实验室的其它同学做都很好。标曲的时候，内参的引物溶解曲线也很好。
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3楼2014-07-14 11:37:36
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:54
扩增效率问题不大，小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染，杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体，引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。
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4楼2014-07-14 14:05:10
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-14 14:05:10
扩增效率问题不大，小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染，杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体，引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。

你好，请问这样还是因为引物设计的不好的问题吗？提高退火温度能改善这种情况吗？

做标准曲线的时候，我选取了6号样品做模板，没有杂峰。
做样品时，6号样品也没有杂峰，但是其他的样品都有，连内参的都有。
所以就怀疑是自己样品的问题。
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5楼2014-07-15 09:55:47
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人生初见 at 2014-07-15 09:55:47
你好，请问这样还是因为引物设计的不好的问题吗？提高退火温度能改善这种情况吗？

做标准曲线的时候，我选取了6号样品做模板，没有杂峰。
做样品时，6号样品也没有杂峰，但是其他的样品都有，连内参的都有。
...

内参基因有多个同源性很高的拷贝，容易有杂带，最好用别人验证过的引物。
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6楼2014-07-15 11:06:36
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xuminga9423

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-15 18:54:23
可以试一下把模板稀释5倍在做，看下是否前面的峰会消失或降低。
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pili
7楼2014-07-15 12:56:55
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taoye5505

新虫 (初入文坛)
目前你们实验培养细胞用的都是什么牌子的血清和培养基效果怎么样
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努力 努力 再努力
8楼2014-07-17 11:51:31
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-15 11:06:36
内参基因有多个同源性很高的拷贝，容易有杂带，最好用别人验证过的引物。...

内参是实验室其他同学用过的，他们用的同样的材料，都没有问题
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9楼2014-07-19 11:29:27
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xuminga9423 at 2014-07-15 12:56:55
可以试一下把模板稀释5倍在做，看下是否前面的峰会消失或降低。

嗯  谢谢  我试试会不会好一些
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10楼2014-07-19 11:30:08
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