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人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 求助qPCR相关问题!新手,真的好纠结啊 已有3人参与

投了文章,让补定量的实验,时间比较紧。但自己是新手,做了之后结果不好,不知道问题出在哪里,还请高手指点啊!!!

做标曲时,目的基因的E=108%, 内参E=98%。 而且目的基因的,除了一个最低浓度的一个孔溶解曲线前面有个小峰外,其余都正常。见图一。
但是做我的样品时候,所有的孔,包括内参引物的在溶解曲线前面都出现了小峰,有的峰值还很高。见图二。
  
我想问:1、内参和目的基因的扩增效率差10%,是不是不能用2−ΔΔCt进行计算呢?优化体系条件能使二者的扩增效率接近吗?
              2、溶解曲线前面出现小峰,是不是因为模板有问题呢?是不是基因组DNA的污染?

真的很着急,不知道该如何解决。

请大家帮帮忙,不甚感激!!

求助qPCR相关问题!新手,真的好纠结啊
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求助qPCR相关问题!新手,真的好纠结啊-1
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:54
扩增效率问题不大,小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染,杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体,引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。
4楼2014-07-14 14:05:10
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 09:08:40
设计的引物不太好,前面的那个小峰应该是引物二聚体,可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。
2楼2014-07-14 07:53:38
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人生初见

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-07-14 07:53:38
设计的引物不太好,前面的那个小峰应该是引物二聚体,可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。

跑胶了,没有二聚体。而且做标曲的时候没有问题,但是做样品就有小峰。内参的也有,内参的引物同实验室的其它同学做都很好。标曲的时候,内参的引物溶解曲线也很好。
3楼2014-07-14 11:37:36
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人生初见

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-14 14:05:10
扩增效率问题不大,小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染,杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体,引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。

你好,请问这样还是因为引物设计的不好的问题吗?提高退火温度能改善这种情况吗?

做标准曲线的时候,我选取了6号样品做模板,没有杂峰。
做样品时,6号样品也没有杂峰,但是其他的样品都有,连内参的都有。
所以就怀疑是自己样品的问题。
5楼2014-07-15 09:55:47
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