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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊
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人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊 已有3人参与

投了文章，让补定量的实验，时间比较紧。但自己是新手，做了之后结果不好，不知道问题出在哪里，还请高手指点啊！！！

做标曲时，目的基因的E=108%, 内参E=98%。 而且目的基因的，除了一个最低浓度的一个孔溶解曲线前面有个小峰外，其余都正常。见图一。
但是做我的样品时候，所有的孔，包括内参引物的在溶解曲线前面都出现了小峰，有的峰值还很高。见图二。
  
我想问：1、内参和目的基因的扩增效率差10%，是不是不能用2−ΔΔCt进行计算呢？优化体系条件能使二者的扩增效率接近吗？
              2、溶解曲线前面出现小峰，是不是因为模板有问题呢？是不是基因组DNA的污染？

真的很着急，不知道该如何解决。

请大家帮帮忙，不甚感激！！

求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊
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求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊-1
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1楼 2014-07-13 21:54:24
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-07-14 07:53:38
设计的引物不太好，前面的那个小峰应该是引物二聚体，可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。

跑胶了，没有二聚体。而且做标曲的时候没有问题，但是做样品就有小峰。内参的也有，内参的引物同实验室的其它同学做都很好。标曲的时候，内参的引物溶解曲线也很好。
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3楼2014-07-14 11:37:36
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 09:08:40
设计的引物不太好，前面的那个小峰应该是引物二聚体，可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。
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2楼2014-07-14 07:53:38
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:54
扩增效率问题不大，小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染，杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体，引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。
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4楼2014-07-14 14:05:10
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人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-14 14:05:10
扩增效率问题不大，小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染，杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体，引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。

你好，请问这样还是因为引物设计的不好的问题吗？提高退火温度能改善这种情况吗？

做标准曲线的时候，我选取了6号样品做模板，没有杂峰。
做样品时，6号样品也没有杂峰，但是其他的样品都有，连内参的都有。
所以就怀疑是自己样品的问题。
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5楼2014-07-15 09:55:47
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