应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊
111/2返回列表12下一页
查看: 2509  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

人生初见

木虫 (小有名气)

[求助] 求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊 已有3人参与

投了文章，让补定量的实验，时间比较紧。但自己是新手，做了之后结果不好，不知道问题出在哪里，还请高手指点啊！！！

做标曲时，目的基因的E=108%, 内参E=98%。 而且目的基因的，除了一个最低浓度的一个孔溶解曲线前面有个小峰外，其余都正常。见图一。
但是做我的样品时候，所有的孔，包括内参引物的在溶解曲线前面都出现了小峰，有的峰值还很高。见图二。
  
我想问：1、内参和目的基因的扩增效率差10%，是不是不能用2−ΔΔCt进行计算呢？优化体系条件能使二者的扩增效率接近吗？
              2、溶解曲线前面出现小峰，是不是因为模板有问题呢？是不是基因组DNA的污染？

真的很着急，不知道该如何解决。

请大家帮帮忙，不甚感激！！

求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊
截图1.png


求助qPCR相关问题！新手，真的好纠结啊-1
截图2.png
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-13 21:54:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 09:08:40
设计的引物不太好，前面的那个小峰应该是引物二聚体，可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。
赞一下 回复此楼
2楼2014-07-14 07:53:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yzj926521 at 2014-07-14 07:53:38
设计的引物不太好，前面的那个小峰应该是引物二聚体，可以用你定量做完的样跑个琼脂糖胶电泳看看。

跑胶了，没有二聚体。而且做标曲的时候没有问题，但是做样品就有小峰。内参的也有，内参的引物同实验室的其它同学做都很好。标曲的时候，内参的引物溶解曲线也很好。
赞一下 回复此楼
3楼2014-07-14 11:37:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:54
扩增效率问题不大，小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染，杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体，引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。
赞一下 回复此楼
4楼2014-07-14 14:05:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-14 14:05:10
扩增效率问题不大，小峰应该是非特异性扩增。
如果是DNA污染，杂带的Tm值一定高于目的带Tm。也不是引物二聚体，引物二聚体的Tm值绝对不可能超过70℃。

你好，请问这样还是因为引物设计的不好的问题吗？提高退火温度能改善这种情况吗？

做标准曲线的时候，我选取了6号样品做模板，没有杂峰。
做样品时，6号样品也没有杂峰，但是其他的样品都有，连内参的都有。
所以就怀疑是自己样品的问题。
赞一下 回复此楼
5楼2014-07-15 09:55:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 人生初见 at 2014-07-15 09:55:47
你好，请问这样还是因为引物设计的不好的问题吗？提高退火温度能改善这种情况吗？

做标准曲线的时候，我选取了6号样品做模板，没有杂峰。
做样品时，6号样品也没有杂峰，但是其他的样品都有，连内参的都有。
...

内参基因有多个同源性很高的拷贝，容易有杂带，最好用别人验证过的引物。
赞一下 回复此楼
6楼2014-07-15 11:06:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuminga9423

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
人生初见(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-15 18:54:23
可以试一下把模板稀释5倍在做，看下是否前面的峰会消失或降低。
赞一下 回复此楼
pili
7楼2014-07-15 12:56:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

taoye5505

新虫 (初入文坛)
目前你们实验培养细胞用的都是什么牌子的血清和培养基效果怎么样
赞一下 回复此楼
努力 努力 再努力
8楼2014-07-17 11:51:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-07-15 11:06:36
内参基因有多个同源性很高的拷贝，容易有杂带，最好用别人验证过的引物。...

内参是实验室其他同学用过的，他们用的同样的材料，都没有问题
赞一下 回复此楼
9楼2014-07-19 11:29:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

人生初见

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xuminga9423 at 2014-07-15 12:56:55
可以试一下把模板稀释5倍在做，看下是否前面的峰会消失或降低。

嗯  谢谢  我试试会不会好一些
赞一下 回复此楼
10楼2014-07-19 11:30:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 人生初见 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 恳请有学校收留 +7 柯淮然 2026-04-12 7/350 2026-04-16 22:50 by cfdbai
[考研] 0831生医工第一轮调剂失败求助 +14 小熊睿睿_s 2026-04-11 18/900 2026-04-16 20:41 by lpl364211
[考研] 335求调剂 +19 想上岸呀！！ 2026-04-12 21/1050 2026-04-14 16:23 by Art1977
[教师之家] 转长聘了 +7 简单化xn 2026-04-13 7/350 2026-04-14 14:50 by xindong
[考研] 考研求调剂 +12 子木呐 2026-04-12 13/650 2026-04-14 01:19 by 王珺璞
[考研] 求调剂 +12 璃茉一定上岸 2026-04-10 13/650 2026-04-14 00:08 by Equinoxhua
[考研] 332求调剂 +15 蕉蕉123 2026-04-10 15/750 2026-04-13 23:12 by pies112
[考研] 0831一轮调剂失败求助 +10 小熊睿睿_s 2026-04-11 10/500 2026-04-12 22:43 by 长弓傲
[考研] 346分，工科0854求调剂，专硕 +6 moser233 2026-04-12 7/350 2026-04-12 22:11 by fqwang
[考研] 339求调剂 +8 hanwudada 2026-04-11 9/450 2026-04-12 15:36 by laoshidan
[考研] 求调剂 +16 张番茄不炒蛋 2026-04-10 17/850 2026-04-12 13:58 by 熬夜成！
[考研] 296求调剂 +14 汪！？！ 2026-04-10 16/800 2026-04-12 10:48 by zhouyuwinner
[考研] 359求调剂 +5 胃痉挛累了 2026-04-11 5/250 2026-04-11 19:55 by lbsjt
[考研] 调剂 +5 文道星台 2026-04-11 5/250 2026-04-11 15:01 by 凯凯要变帅
[考研] 0854调剂 +5 音像店听花鼓戏 2026-04-10 5/250 2026-04-11 10:49 by qingpingzhu
[考研] 284求调剂 +12 archer.. 2026-04-10 13/650 2026-04-11 08:44 by zhq0425
[考研] 本科211 工科085400 280分求调剂 可跨专业 +11 LZH（等待调剂中 2026-04-10 11/550 2026-04-11 08:39 by zhq0425
[考研] 材料与化工调剂 +12 否极泰来2026 2026-04-10 13/650 2026-04-11 00:28 by wangjihu
[考研] 265求调剂 +12 风说她早忘了 2026-04-10 13/650 2026-04-10 18:56 by chemisry
[考研] 085800 能源动力求调剂 +6 阿biu啊啊啊啊啊 2026-04-10 6/300 2026-04-10 15:03 by hemengdong
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭