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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白上清表达无活性，求复性方法
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linden00

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白上清表达无活性，求复性方法 已有2人参与

我的蛋白在上清中有大量表达，但是做EMSA检测无活性，看文献中是降低盐酸胍浓度来复性的。有没有人做过柱上复性的？想知道具体方法。我是应该直接按包涵体的方法复性还是上清在镍柱纯化的同时复性呢？另外蛋白中有几个半胱氨酸，没有二硫键，是不是一定要加巯基乙醇来保护巯基？
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1楼 2015-05-26 11:01:46
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qc程程
2楼2015-05-26 15:26:27
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
纳尼，在上清中不就是可溶的么？  你复性也是为了可溶呀？这不是画蛇添足么。
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3楼2015-05-26 15:42:07
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linden00

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-05-26 15:42:07
纳尼，在上清中不就是可溶的么？  你复性也是为了可溶呀？这不是画蛇添足么。

但是上清无活性呀
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4楼2015-05-26 17:11:09
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
linden00: 金币+10 2015-05-27 10:04:33
如果是核酸结合蛋白，有没有考虑到buffer不适当，并不是蛋白没有活性？

比如加入10 mM Mg ++ ,  10 uM Zn ++?
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2015-05-26 19:28:31
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linden00

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pennchem at 2015-05-26 19:28:31
如果是核酸结合蛋白，有没有考虑到buffer不适当，并不是蛋白没有活性？

比如加入10 mM Mg ++ ,  10 uM Zn ++?

有按参考文献加入镁离子，不知道是不是没有加还原剂保护巯基的原因，如果需要加还原剂一般是多大浓度
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6楼2015-05-26 19:44:04
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

方便的话，站内给我你的蛋白序列或者文献
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行至水穷处，坐看云起时
7楼2015-05-26 19:58:36
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
能表达到上清中，应该不是包涵体吧，为什么要复性，应该考虑是不是其他方面影响了酶的活性？
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nothing isimpossible
8楼2015-05-27 15:17:25
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qc程程
9楼2015-05-28 09:17:14
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lha123

铜虫 (小有名气)
采用的是大肠杆菌表达的吧，蛋白没有活性可能是由于蛋白需要修饰，采用其他的表达体系如酵母表达可以试试啊
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加油！2015
10楼2015-06-03 10:36:45
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