| 查看: 2367 | 回复: 7 | ||
youyouzi2010银虫 (小有名气)
|
[求助]
GST包涵体蛋白复性后挂不上柱子，急急急~~
|
|
各位哥哥姐姐，我做的蛋白是37KD的，加上GST标签是65kd左右，目前我的蛋白已经表达出来了，是包涵体，无论是od=0.3 低浓度IPTG+低温过夜，蛋白都是包涵体。由于纯化出来要上动物，就选择了尿素纯化。 我菌体是用溶菌酶+超声裂解400W,超3停5，之后沉淀再用核酸酶处理。 我先用2M的尿素洗涤沉淀，再用8M的尿素溶解沉淀，尿素都是溶解在50mM的tris-hcl中。 再用透析去除尿素，并且复性。 我的透析液是PBS， 我的透析的尿素梯度是4M 2M 0.2M 0 PH梯度是8.2 7.8 7.4 7.4 然后透析液上GE的gst FF 柱子 我用的柱子是我师姐留下来的，过期了差不多1年 洗脱是10mM的还原性谷胱甘肽， 之后跑胶 发现洗脱下来的，几乎没有我的目的蛋白，只有一点点浅浅的条带，不仔细看看不出来。 而且我也在样品里面加了DTT 我隔壁实验室的说是柱子过期了也能用，说是我复性的时候GST的构象破坏了，到底该怎么办啊？？我实验室就我一个做纯化 |
回复此楼» 猜你喜欢
面上提前没消息，有中的吗
已经有17人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有7人回复
-
售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有5人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有10人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有9人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急
已经有10人回复
-
系统今天又提示维护了，估计离放榜不远了
已经有16人回复
-
一个有机合成实验室都需要哪些设备？
已经有10人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急
已经有9人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有13人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于包涵体复性百分之80%全部沉淀，求指教。
已经有5人回复
- 目的蛋白表达纯化，求教高手
已经有12人回复
- 包涵体的变复性
已经有4人回复
- 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题
已经有20人回复
- 包涵体复性试剂盒
已经有7人回复
- 关于重组蛋白包涵体的溶解及复性
已经有5人回复
- GST融合蛋白洗脱时洗脱不下来，怎么办
已经有9人回复
- Q-Sepharose Fast Flow 纯化蛋白遇到的棘手问题
已经有11人回复
- 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
已经有20人回复
- 包涵体蛋白纯化不溶解，怎麽办？
已经有20人回复
- 如何解决包涵体复性沉淀问题？
已经有16人回复
- 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
已经有20人回复
- GST柱纯化蛋白 是否变性
已经有6人回复
- 包涵体变性、复性
已经有4人回复
- gst标签蛋白的表达和纯化
已经有17人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- 求助：纯化蛋白遇到包涵体了，尿素怎么用？
已经有17人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 包涵体变性复性
已经有11人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
lpzl
木虫 (正式写手)
- 应助: 59 (初中生)
- 金币: 4125.1
- 红花: 2
- 帖子: 306
- 在线: 526.2小时
- 虫号: 2412684
- 注册: 2013-04-11
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2014-04-01 08:33:46
chlorella409
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 3245.6
- 散金: 1000
- 红花: 4
- 帖子: 376
- 在线: 182.4小时
- 虫号: 1600249
- 注册: 2012-02-05
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
3楼2014-04-01 08:40:35
chlorella409
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 3245.6
- 散金: 1000
- 红花: 4
- 帖子: 376
- 在线: 182.4小时
- 虫号: 1600249
- 注册: 2012-02-05
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
4楼2014-04-01 09:01:54
youyouzi2010
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 463.6
- 散金: 2
- 红花: 1
- 帖子: 82
- 在线: 248.5小时
- 虫号: 1125506
- 注册: 2010-10-18
- 专业: 蛋白质组学
我已经透析去掉了尿素，并且更换了4次透析液，里面应该没有尿素了 5楼2014-04-01 10:11:13
chlorella409
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 3245.6
- 散金: 1000
- 红花: 4
- 帖子: 376
- 在线: 182.4小时
- 虫号: 1600249
- 注册: 2012-02-05
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
6楼2014-04-01 11:16:53
youyouzi2010
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 463.6
- 散金: 2
- 红花: 1
- 帖子: 82
- 在线: 248.5小时
- 虫号: 1125506
- 注册: 2010-10-18
- 专业: 蛋白质组学
试试看吧 7楼2014-04-01 13:21:22
raycupid
金虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1393.1
- 帖子: 30
- 在线: 18.7小时
- 虫号: 2160356
- 注册: 2012-12-02
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
8楼2017-02-26 11:33:48
50