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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » GST融合蛋白洗脱时洗脱不下来，怎么办
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

[求助] GST融合蛋白洗脱时洗脱不下来，怎么办

最近在做GST-pull down实验，gst 融合蛋白表达出来了，也挂柱了，但是用还原型谷胱甘肽洗脱时洗不下来，还都挂在beads上，，不知怎么办了，我用的洗脱液是100mM谷胱甘肽，50mM的Tric-Hcl，PH8.0  ，求大神帮助，谢谢
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多情总被无情扰。。。愁
1楼 2012-11-27 10:26:16
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hu6704526

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个是一个比较普通的实验，如果你的实验都是没有问题的话，是不会没有结果的。请确认在每步操作中都达到了理论上所需求的参数要求。
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2楼2012-11-27 12:28:33
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人感觉你的蛋白不是没有洗脱下来，而是沉淀在柱上面了。
建议，下次纯化的时候，把50mMTris，降到10-20mM，同时把PH提主高到8.5-9.0之间，还有上样量减少点。
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3楼2012-11-27 14:20:15
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jiaolong11a: 金币+1, ★有帮助 2012-11-29 20:07:03
同意楼上观点哈，像是沉淀了~当然还有个建议是稍微加点甘油可以稳定蛋白~
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4楼2012-11-27 14:28:08
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-11-27 14:20:15
个人感觉你的蛋白不是没有洗脱下来，而是沉淀在柱上面了。
建议，下次纯化的时候，把50mMTris，降到10-20mM，同时把PH提主高到8.5-9.0之间，还有上样量减少点。

我在网上看谷胱甘肽的浓度大约在20-50mM之间，但我的是在100mM之间，不知有没有影响？上样量减少是什么意思， 是指减少纯化的菌量吗？
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多情总被无情扰。。。愁
5楼2012-11-28 09:33:29
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-27 14:28:08
同意楼上观点哈，像是沉淀了~当然还有个建议是稍微加点甘油可以稳定蛋白~

我后面还有做蛋白的相互作用实验，不知加甘油后是否有影响？
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多情总被无情扰。。。愁
6楼2012-11-28 09:47:46
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by jiaolong11a at 2012-11-28 09:47:46
我后面还有做蛋白的相互作用实验，不知加甘油后是否有影响？...

可以之后用透析的方法去掉嘛~
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7楼2012-11-28 14:39:03
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)
我好想是发现问题所在了，我的PH值是在加谷胱甘肽之前调的，由于谷胱甘肽浓度太大， 溶液已成酸性，原因可能就在这，我再试一次吧
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多情总被无情扰。。。愁
8楼2012-11-29 20:08:59
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake
在吗？？？我也在做这个实验，有问题需要向你请教，谢谢！
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9楼2016-06-24 20:11:29
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菱霖飞飞飞

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jiaolong11a at 2012-11-29 20:08:59
我好想是发现问题所在了，我的PH值是在加谷胱甘肽之前调的，由于谷胱甘肽浓度太大， 溶液已成酸性，原因可能就在这，我再试一次吧

请问确实是pH没有再调节的问题吗？因为我也出现了同样的情况
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10楼2019-06-03 10:04:14
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