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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 洗脱不下来，怎么办？
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yuehuashou

新虫 (初入文坛)

[求助] 洗脱不下来，怎么办？

前天做免疫亲和层析，填料是CNBr activated sepharose 4B，用抗体交联，样品溶解于PBS，洗脱液是pH2.5 0.1M Gly-Hcl，过柱后用pH 8.4 1M Tris-Hcl中和，然后用ELISA检，洗脱液没有阳性反应，我用PBS溶解标样，浓度是样品的1000倍左右，同样的操作，ELISA检有阳性反应，样品中目的蛋白的浓度很低，不过标样能洗脱下来，那么样品也能够洗脱下来才对，更奇怪的是ELISA结果显示标样过柱后的浓度比没过柱的大（两次用的同一柱）。实验时我发现洗脱下来液体很浑浊，中和后便澄清，怀疑可能是目的蛋白发生了酸解，于是直接用洗脱液稀释样品，然后以10s为间隔中和，用ELISA检，发现一分钟内对目的蛋白没影响。请教大家我的实验到底是什么地方出了问题，是不是没有洗脱下来，应该怎样改进，我打算换洗脱条件，用中性pH高盐的洗脱液洗，不知道是不是洗脱液的问题......
补充一下，要纯化的目的蛋白来自棉花，标样得自细菌。刚接触免疫亲和层析，希望得到大家的帮助，非常感谢！
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1楼 2012-05-23 09:16:17
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhaohq1209: 金币+2, 鼓励交流~有帮助 2012-05-25 13:43:10
粗略分析一下，如果标记物可被洗脱，那目的蛋白也应该会被洗脱。楼主可以做一个20CV梯度洗脱观察一下不同浓度洗脱缓冲液作用下，目的蛋白的洗脱量。建议你提高到1M Gly-Hcl的浓度来做梯度洗脱。出现这种情况的可能性不外乎ph不正确，盐浓度不正确。
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2楼2012-05-24 14:54:17
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yuehuashou

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2012-05-24 14:54:17:
粗略分析一下，如果标记物可被洗脱，那目的蛋白也应该会被洗脱。楼主可以做一个20CV梯度洗脱观察一下不同浓度洗脱缓冲液作用下，目的蛋白的洗脱量。建议你提高到1M Gly-Hcl的浓度来做梯度洗脱。出现这种情况的可能性

我也很奇怪，标样能洗脱下来，那么样品中的目的蛋白也应该能洗脱下来才对，虽然标样和样品中的蛋白因为分别来自原核和真核，可能在性质上有不同，但ELISA显示抗体与两者都能结合，所以我估计不会是抗体的问题。将洗脱液中的Gly浓度增加能洗脱下来吗，在不改变pH的条件下？我后来在洗脱液中加入了0.5M的NaCl，依旧没洗脱下来，改变Gly的浓度和改变NaCl的浓度由区别吗？
出现这种结果会不会是因为样品中的目的蛋白太少，以至于就算洗脱条件够了，但因为热力学上的原因使得目的蛋白洗脱不下来？还有我想问一下离液盐是什么盐，离液序列高是什么意思，这种盐的作用机制是什么？
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3楼2012-05-24 23:18:53
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hinge1001

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

“浓度是样品的1000倍左右”就是说你的样品的浓度是很低的，检不出来也正常，“更奇怪的是ELISA结果显示标样过柱后的浓度比没过柱的大”柱层析后有浓缩效果，这没什么奇怪的，建议你还是加大上样量，以先能拿到你的目标蛋白为准，对于亲和层析来说，摸条件相对要简单许多
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4楼2012-05-29 08:58:44
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xiejinhui

金虫 (小有名气)
楼主的问题解决没有啊，我也遇到难题啦，有机会能不能交流下啊。
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5楼2012-06-08 16:57:12
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xiejinhui

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2012-05-24 14:54:17
粗略分析一下，如果标记物可被洗脱，那目的蛋白也应该会被洗脱。楼主可以做一个20CV梯度洗脱观察一下不同浓度洗脱缓冲液作用下，目的蛋白的洗脱量。建议你提高到1M Gly-Hcl的浓度来做梯度洗脱。出现这种情况的可能性 ...

像这种一般不就是pH就行了么，盐浓度就是保护洗脱下来的目的蛋白嘛。
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6楼2012-06-08 17:03:10
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llyman

银虫 (小有名气)
同样开始接触免疫试验，学习中
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7楼2013-03-21 09:43:40
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