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yuehuashou新虫 (初入文坛)
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洗脱不下来，怎么办？
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前天做免疫亲和层析，填料是CNBr activated sepharose 4B，用抗体交联，样品溶解于PBS，洗脱液是pH2.5 0.1M Gly-Hcl，过柱后用pH 8.4 1M Tris-Hcl中和，然后用ELISA检，洗脱液没有阳性反应，我用PBS溶解标样，浓度是样品的1000倍左右，同样的操作，ELISA检有阳性反应，样品中目的蛋白的浓度很低，不过标样能洗脱下来，那么样品也能够洗脱下来才对，更奇怪的是ELISA结果显示标样过柱后的浓度比没过柱的大（两次用的同一柱）。实验时我发现洗脱下来液体很浑浊，中和后便澄清，怀疑可能是目的蛋白发生了酸解，于是直接用洗脱液稀释样品，然后以10s为间隔中和，用ELISA检，发现一分钟内对目的蛋白没影响。请教大家我的实验到底是什么地方出了问题，是不是没有洗脱下来，应该怎样改进，我打算换洗脱条件，用中性pH高盐的洗脱液洗，不知道是不是洗脱液的问题...... 补充一下，要纯化的目的蛋白来自棉花，标样得自细菌。刚接触免疫亲和层析，希望得到大家的帮助，非常感谢！ |
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yuehuashou
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