应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » GST包涵体蛋白复性后挂不上柱子，急急急~~
51/1返回列表
查看: 2089  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

youyouzi2010

银虫 (小有名气)

[求助] GST包涵体蛋白复性后挂不上柱子，急急急~~

各位哥哥姐姐，我做的蛋白是37KD的，加上GST标签是65kd左右，目前我的蛋白已经表达出来了，是包涵体，无论是od=0.3 低浓度IPTG+低温过夜，蛋白都是包涵体。由于纯化出来要上动物，就选择了尿素纯化。
我菌体是用溶菌酶+超声裂解400W,超3停5，之后沉淀再用核酸酶处理。
我先用2M的尿素洗涤沉淀，再用8M的尿素溶解沉淀，尿素都是溶解在50mM的tris-hcl中。
再用透析去除尿素，并且复性。
我的透析液是PBS，
我的透析的尿素梯度是4M 2M 0.2M 0
PH梯度是8.2  7.8 7.4 7.4

然后透析液上GE的gst FF  柱子  我用的柱子是我师姐留下来的，过期了差不多1年
洗脱是10mM的还原性谷胱甘肽，
之后跑胶
发现洗脱下来的，几乎没有我的目的蛋白，只有一点点浅浅的条带，不仔细看看不出来。
而且我也在样品里面加了DTT

我隔壁实验室的说是柱子过期了也能用，说是我复性的时候GST的构象破坏了，到底该怎么办啊？？我实验室就我一个做纯化
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
有所为而有所不为
1楼 2014-04-01 01:09:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chlorella409

木虫 (正式写手)
★ ★
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2014-04-01 16:38:15
额……错了，GST柱子不能在尿素里上样，柱子的基团会被变性，就不能结合蛋白了
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-01 09:01:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

lpzl

木虫 (正式写手)
学习学习。。。
回复此楼
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-04-01 08:33:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+3, 谢谢参与 2014-04-01 16:36:24
还是建议先换根柱子，我们纯化过程发现柱子的性能有很大关系，至于复性破坏构象的话，总有一部分蛋白是正确折叠的。实在不行你就在尿素里上下柱子看看有没有目的地条带。
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-01 08:40:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

youyouzi2010

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chlorella409 at 2014-04-01 09:01:54
额……错了，GST柱子不能在尿素里上样，柱子的基团会被变性，就不能结合蛋白了

我已经透析去掉了尿素，并且更换了4次透析液，里面应该没有尿素了
赞一下 回复此楼
有所为而有所不为
5楼2014-04-01 10:11:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭