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youyouzi2010银虫 (小有名气)
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GST包涵体蛋白复性后挂不上柱子，急急急~~
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各位哥哥姐姐，我做的蛋白是37KD的，加上GST标签是65kd左右，目前我的蛋白已经表达出来了，是包涵体，无论是od=0.3 低浓度IPTG+低温过夜，蛋白都是包涵体。由于纯化出来要上动物，就选择了尿素纯化。 我菌体是用溶菌酶+超声裂解400W,超3停5，之后沉淀再用核酸酶处理。 我先用2M的尿素洗涤沉淀，再用8M的尿素溶解沉淀，尿素都是溶解在50mM的tris-hcl中。 再用透析去除尿素，并且复性。 我的透析液是PBS， 我的透析的尿素梯度是4M 2M 0.2M 0 PH梯度是8.2 7.8 7.4 7.4 然后透析液上GE的gst FF 柱子 我用的柱子是我师姐留下来的，过期了差不多1年 洗脱是10mM的还原性谷胱甘肽， 之后跑胶 发现洗脱下来的，几乎没有我的目的蛋白，只有一点点浅浅的条带，不仔细看看不出来。 而且我也在样品里面加了DTT 我隔壁实验室的说是柱子过期了也能用，说是我复性的时候GST的构象破坏了，到底该怎么办啊？？我实验室就我一个做纯化 |
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