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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » GST包涵体蛋白复性后挂不上柱子，急急急~~
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youyouzi2010

银虫 (小有名气)

[求助] GST包涵体蛋白复性后挂不上柱子，急急急~~

各位哥哥姐姐，我做的蛋白是37KD的，加上GST标签是65kd左右，目前我的蛋白已经表达出来了，是包涵体，无论是od=0.3 低浓度IPTG+低温过夜，蛋白都是包涵体。由于纯化出来要上动物，就选择了尿素纯化。
我菌体是用溶菌酶+超声裂解400W,超3停5，之后沉淀再用核酸酶处理。
我先用2M的尿素洗涤沉淀，再用8M的尿素溶解沉淀，尿素都是溶解在50mM的tris-hcl中。
再用透析去除尿素，并且复性。
我的透析液是PBS，
我的透析的尿素梯度是4M 2M 0.2M 0
PH梯度是8.2  7.8 7.4 7.4

然后透析液上GE的gst FF  柱子  我用的柱子是我师姐留下来的，过期了差不多1年
洗脱是10mM的还原性谷胱甘肽，
之后跑胶
发现洗脱下来的，几乎没有我的目的蛋白，只有一点点浅浅的条带，不仔细看看不出来。
而且我也在样品里面加了DTT

我隔壁实验室的说是柱子过期了也能用，说是我复性的时候GST的构象破坏了，到底该怎么办啊？？我实验室就我一个做纯化
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有所为而有所不为
1楼 2014-04-01 01:09:02
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youyouzi2010

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chlorella409 at 2014-04-01 11:16:53
我本意是让你在尿素里上样，因为变性条件下标签会被打开，利于结合，但是在尿素里GST柱子的配基也是变性的，不能结合GST tag，我没有说你透析不完全，建议还是换柱子试试吧，有可能配基失效了...

试试看吧
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有所为而有所不为
7楼2014-04-01 13:21:22
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lpzl

木虫 (正式写手)
学习学习。。。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-04-01 08:33:46
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+3, 谢谢参与 2014-04-01 16:36:24
还是建议先换根柱子，我们纯化过程发现柱子的性能有很大关系，至于复性破坏构象的话，总有一部分蛋白是正确折叠的。实在不行你就在尿素里上下柱子看看有没有目的地条带。
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3楼2014-04-01 08:40:35
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chlorella409

木虫 (正式写手)
★ ★
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2014-04-01 16:38:15
额……错了，GST柱子不能在尿素里上样，柱子的基团会被变性，就不能结合蛋白了
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-01 09:01:54
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