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1279341226

新虫 (初入文坛)

[求助] 请分子生物学高手帮忙看看下面的PCR体系... 已有4人参与

Each primer pair was used in 20 μl  volume reactions containing 300 nM dNTPs (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland),1×DNA pol buffer (Biotools BandM labs S.A., Madrid, Spain),
3 mM MgCl2 (Biotools), 0.75  μ DNA polymerase (Biotools), 10 pmol each primer (depending on marker), and 10 ng of total DNA.
       本人在用通用引物 LCO1498 and HCO2198 扩寄生蜂线粒体基因 coi ,无奈老是做不出来,想按照文献上别人的方法试试,可是体系怎么看不懂呢,括号后面的是生物公司还是某什么啊,我用的是TaKaRa 公司的酶( 5U/ μl ),10×PCR Buffer( with Mg2+ ) , dNTP Mixture(各 2.5 mM),  他们用的试剂可以在哪个公司订到吗?急!急!!急!!!
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chiangscn

银虫 (正式写手)

真是笑话,做个PCR难道还要把那个牌子的试剂? 最可能的问题来自引物的特异性(与质量)与退火温度。可以试着进行二次扩增。
wholaughslastlaughsbest
7楼2015-04-07 08:38:17
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

普通的Taq DNA聚合酶可能不能达到扩增的效果,选酶还是很重要的http://www.detaibio.com/dna-taq-polymerase.html写的挺好的,呵呵,我们都是用热启动聚合酶,感觉很好,我现在也在找其他的酶,想尝试高保真酶,或是能进行长片段PCR的,你的这个体系看不出有什么问题啊,你应该把你的扩增结果发上来,出现什么问题了,也许那样解决会更好
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-04-07 11:21:23
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普通回帖

-字仲康

禁虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
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2楼2015-04-03 23:07:46
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-字仲康

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

3楼2015-04-03 23:08:42
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1279341226

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by -字仲康 at 2015-04-03 23:07:46
额,论坛是怎么了,怎么那么冷清。我是复制查看了一下你说的括号里面的东西,应该是产地和公司之类的吧
你写出来的是产品的说明书么。扩增不出来,看你用的是什么聚合酶,建议是看看说明书

不是说明书,是看的文献里面人家的体系,我用的是TaKaRa普通酶,曾按照酶说明书上的体系试过,还是做不出来啊,忧伤额。。。
4楼2015-04-06 20:35:21
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hkj710

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主可以看看我的PCR体系,基本上我的体系都是这样
10xbuffer (含mg2+ 1.5mM)            2ul
dNTP (10 mM)                            0.5ul
primer1 (10 uM)                         0.5ul
primer2 (10 uM)                         0.5ul
template (基因组DNA)                100ng
TAQ                                              1U
H2O   TO                                     20ul
mg的含量可以根据条件来变化,从1.5mM到5mM都可以,酶的多少看你的购买的公司的酶的浓度。
5楼2015-04-07 04:12:39
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

基本不用参考文献的PCR体系,只要引物序列一样,模版一样就可以,你需要关注的是你自己用的酶的条件,楼上问了什么酶,楼主却只说takara,说明楼主对PCR酶了解不多,PCR用的酶有很多种,有容易扩增的easytaq、高保真的PFU等等,根据目的选用不同的酶,看清楚厂家的说明书、再优化退火温度,祝好!
科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
6楼2015-04-07 08:17:14
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1279341226

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hkj710 at 2015-04-07 04:12:39
楼主可以看看我的PCR体系,基本上我的体系都是这样
10xbuffer (含mg2+ 1.5mM)            2ul
dNTP (10 mM)                            0.5ul
primer1 (10 uM)                         0.5ul
primer2 ( ...

好的,我试试,多谢啦~~~~
9楼2015-04-07 17:10:51
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1279341226

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by dehong1573 at 2015-04-07 08:17:14
基本不用参考文献的PCR体系,只要引物序列一样,模版一样就可以,你需要关注的是你自己用的酶的条件,楼上问了什么酶,楼主却只说takara,说明楼主对PCR酶了解不多,PCR用的酶有很多种,有容易扩增的easytaq、高保真 ...

那我这种情况用哪种酶比较好呢,首先虫子太小,都是单头无损伤提取的,可能得到的模板浓度也比较低,扩增核基因 28s 很容易,但是要扩增的另一段线粒体基因 coi 就不行,可能线粒体基因要求的模板浓度比较高吧,总之就是扩不出来呀。。
10楼2015-04-07 17:22:31
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